诱导性多潜能干细胞(iPS cells) 现状及前景展望

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作者：申红芬 1, 3)** 姚志芳 1)** 肖高芳 1) 贾俊双 1) 肖 东 1, 2)*** 姚开泰 1, 3)*** (1)南方医科大学肿瘤研究所，广州 510515；2)南方医科大学比较医学研究所暨实验动物中心，广州 510515； 3)中南大学肿瘤研究所， 长沙 410078)
 

摘要 主要从 iPS 细胞发展历程、获得 iPS 细胞的几个关键步骤 (如基因导入方式、诱导 iPS 细胞所需因子组合与小分子化 合物运用和体细胞种类选择等)、病人或疾病特异性 iPS 细胞、iPS 细胞体内外诱导分化与其衍生物的临床应用和制备无遗传 修饰的(genetic modification-free) iPS 细胞的可行性与前景等方面对 iPS 细胞最新研究进展做评述．日本和美国研究小组先后 用 4 种基因将小鼠(2006 年 8 月)和人(2007 年 11～12 月)的体细胞在体外重编程为诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)，此后在短短两年多时间内，iPS 细胞的研究和关注度呈爆炸式增长．体细胞重编程、去分化和多潜能 干细胞来源等一系列热点问题再次成为干细胞和发育生物学等研究的热点和焦点．与胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES cells)一样，iPS 细胞在体内可分化为 3 个胚层来源的所有细胞，进而参与形成机体所有组织和器官．迄今，在体外已由 iPS 细胞定向诱导分化出功能性的多种成熟细胞．因此，iPS 细胞研究不仅具有重要理论意义，而且在再生医学、组织工程和药 物发现与评价等方面极具应用价值．
 

关键词 体细胞重编程，胚胎干细胞，诱导性多潜能干细胞，分化，细胞治疗，无遗传修饰的重编程方法，小分子 学科分类号 Q813，Q75 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2008.00794
 

由于人的胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES cells)在再生医学、组织工程和药物发现与评价等 领域极具应用价值，科学家们曾尝试通过不同途径 实现体细胞重编程以获取 ES 细胞或 ES 细胞样的 细胞或多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells， iPS cells)，这些途径主要包括：a．体细胞核移植， b．体细胞与多潜能细胞融合后的重编程，c．将分 化的体细胞在卵细胞或多潜能干细胞的抽提物中孵 育以实现体细胞重编程，d．体细胞经特定因子诱 导重编程为 iPS 细胞[1～4] ．虽然运用前 3 种方法可 以获得多潜能干细胞，但是这些方法的广泛应用在 技术、细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律等 方面存在诸多限制，而 iPS 细胞不受这些问题的限 制并且制备简单易行，故 iPS 细胞一经问世，即在 生命科学领域引起了一次轰动，被誉为生命科学领 域新的里程碑．什么是 iPS 细胞呢？简单来说就是 借助基因导入技术将某些特定因子导入动物或人的 体细胞，同时可选择性地在培养液中加入特定的小 分子物质，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞，此类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物、基 因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体(embryoid bodies，EBs)形成、畸胎瘤(teratoma)形成和嵌合体 (chimeras)形成(针对小鼠)等方面与 ES 细胞非常相 似．本文主要从 iPS 细胞发展历程、获得 iPS 细胞 的几个关键步骤 (如基因导入方式、诱导 iPS 细胞 所需因子组合与小分子化合物运用和体细胞种类选 择等)、病人或疾病特异性 iPS 细胞、iPS 细胞体内 外诱导分化与其衍生物的临床应用和制备无遗传修 饰的 iPS 细胞的可行性与前景等方面对 iPS 细胞最 新研究进展做评述．此外，有关 iPS 细胞早期和其他方面的进展，可参见其他中文综述[1,5～10]． 1 iPS 细胞发展历程 如表 1 所示[11～47]，2006 年 8 月，Yamanaka 小 组将 24 种转录因子排列组合导入小鼠成纤维细胞， 最终确定最少有 4 种转录因子组合—— —Oct4、 Sox2、c-Myc 和 Klf4 即可将成纤维细胞重编程为 iPS 细 胞[11]，2007 年 11～12 月，Yamanaka 小组和 Thomson 小组先后将人的体细胞重编程为 iPS 细 胞[12, 13]．这之后 iPS 细胞的研究和关注度呈爆炸式 增长(表 1)，且取得了一些突破性进展，如建立了疾病特异的人 iPS 细胞[28, 29]、借助转座子介导的转 基因方法高效制备了 virus-free iPS 细胞[45, 46]以及成 功地从所获得的 iPS 细胞中移除先前导入的转录因 子基因[45～47]．在利用特定小分子化合物的情况下， 更少 的外源基因导入即可高效率获得 iPS 细胞， 这向制备无遗传修饰的 iPS 细胞方面迈出了一大 步[20, 23, 24, 26, 37, 39, 40, 45～48]，此外，亦建立了大鼠和猴的 iPS 细胞系[41～43]，其余进展详见表 1，这些成绩将 iPS 细胞在临床上的实际应用又大大向前推进了一 步，iPS 细胞研究和应用将有望成为 21 世纪最伟 大的医学生物学成就之一.

 

Table 1 The history of induced pluripotent stem cells (iPS cells) 表 1 诱导性多潜能干细胞 (iPS cells) 大事记

2 制备 iPS 细胞的几个关键步骤和环节 

目前，iPS 细胞制备流程及其鉴定如图 1 所 示，简言之：a．分离和培养宿主细胞；b．通过病 毒 (逆转录病毒、慢病毒或腺病毒) 介导的方式将 外源基因导入宿主细胞；c．将病毒感染后的细胞 种植于饲养层细胞上，并于 ES 细胞专用培养体系 中培养，同时在培养液中根据需要加入相应的小分 子 物 质 ( 如 Wnt3a、 5-AZA、 BIX-01294、 VPA、
TSA、BayK8644、PD0325901 或 CHIR99021 等)以 促进重编程；d．数天后，出现 ES 克隆样的克隆； e．在细胞形态、基因表达谱、表观遗传学、畸胎 瘤形成和体外分化等方面对这些克隆进行鉴定．鉴 于刘爽等[9]已对制备 iPS 细胞的一般过程及其鉴定 做了较详细的描述，此不赘言．此外，Takahashi 等[49]和 Park 等[50]分别描述了制备小鼠和人 iPS 细胞 的详细步骤．本部分仅结合 iPS 细胞最新研究进展 对一些关键步骤和环节加以评述。

2．1 体细胞种类选择原则和体细胞重编程为 iPS 细胞所需因子组合确定原则 表 2、表 3 和表 4 展示了迄今通过不同转录因 子的组合或额外加入小分子，将小鼠或人的体细胞 重编程为 iPS 细胞的情况．Yamanaka 小组用 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 4 种转录因子组合先 后将小鼠和人的成纤维细胞在体外诱导为 iPS 细 胞[11, 12]，这之后不同的研究小组又运用相似的方法 和采用不同因子的组合证实了该方法的可行性，同 时也发现，被逆转的细胞不局限于特定的细胞类型 及特定的分化阶段，其可以是内中外三胚层任一胚 层来源的细胞，既可以来源于胚胎细胞也可以来源 于新生儿、成人甚至是终末分化的成熟细胞(表 2、 表 3 和表 4)，只是不同胚层来源的细胞或不同发 育阶段的细胞重编程为 iPS 细胞的难易不同、效率不同、所需因子组合不同或形成克隆所需时间不同 而已．Jaenisch 小组借助新近建立的药物可诱导系 统来研究体细胞重编程为 iPS 细胞，得出如下结 论：a．不同诱导水平的重编程因子均可将体细胞 诱导为 iPS 细胞；b．转录因子转基因活性的持续 时间与重编程效率有直接相关性；c．许多不同组 织来源的体细胞均可被重编程；d．不同类型体细 胞重编程为 iPS 细胞所需转录因子诱导水平是不同 的[45]．总之，任何一种 (小鼠和人的)体细胞在理论 上均可被这些转录因子重编程为 iPS 细胞．由于人 的血细胞(如 T 细胞和 B 细胞等)、脂肪细胞和皮肤 成纤维细胞取材方便及来源广泛，故此类人的体细 胞是较为理想的供体细胞，适用于建立“个体特异 的”、“病人特异的”或“疾病特异的”iPS 细胞.

体细胞重编程为 iPS 细胞所需转录因子组合需 根据体细胞种类及其相应转录因子表达水平或额外 加入的小分子化合物加以灵活选择(表 2、表 3 和 表 4)．一般，Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4 组合或 Oct4、Sox2、Klf4 组合即可将体细胞重编程为 iPS 细胞，只是后一种组合重编程的效率较前一种低许 多(表 2、表 3 和表 4)．当选用小分子化合物时， 可大幅度提高重编程效率和 / 或减少转录因子使用 个数[20, 23, 24, 26, 37, 39, 40]，增加转录因子使用个数(Oct4、 Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc 和 Klf4)，也可大幅 度提高重编程效率[61]．又如 Oct4 和 Klf4 2 种基 因，甚至只用 Oct4 一个基因，即可将神经干细胞 或前体细胞转化成 iPS 细胞，这主要由于这些细胞 本身高表达 Sox2、c-Myc 和 Klf4 [20, 22,