【实验技术笔记】细胞表型检测之细胞增殖（CCK-8法 + BrdU掺入法 + 平板克隆）

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1. 细胞增殖的定义

• 通过检测细胞数量来判断细胞是否增殖：CCK-8 法，MTT 法。
  推荐 CCK-8 法，灵敏度高，重复性好，数据可靠，操作简便，省时省力。水溶性，不需要换液，尤其适合悬浮细胞，不需要加放射性同位素或有机溶剂，基本无细胞毒性，不伤害细胞，检测完后的细胞可重复利用。开盖即用，不需要配制。
• 通过检测细胞分裂时的物质变化来判断细胞是否增殖：BrdU 掺入法

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2. 检测细胞数量：CCK-8 法

(1) Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 分析细胞增殖的原理：

试剂盒中的水溶性四唑盐 WST-8 是 CCK-8 的主要成分，粉色，可以直接加入细胞中，在电子载体 1-Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜类染料（Formazan），并释放到细胞外溶解在培养基中，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

• 适用于检测贴壁细胞和悬浮细胞数量
• 不能检测组织中的细胞数量
• 不能确认细胞数量的变化是由细胞增殖增多还是细胞凋亡减少引起的，需要配合其他实验结果进行综合判断

(2) CCK-8 测细胞增殖操作流程

★ 预实验：做几个孔，摸索接种细胞的数量 和 加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

• 接种细胞数量：CCK-8 至少要测 5 天，因此接种的细胞量要保证长到第五天时，细胞不能长得太满。
• 培养时间：根据细胞种类不同、每孔细胞数量多少来定。如，白细胞难显色，因此要培养时间较长或要增加细胞数量；悬浮细胞相对于贴壁细胞更难显色，加入 CCK-8 1-4h 后用肉眼看下显色程度，或用酶标仪检测，如果显色困难，就将培养板再放回培养箱继续培养数小时；贴壁细胞培养 30min 就可以取出来看显色程度。CCK-8 最佳反应时间是以具体显色的最佳时间为准。

★ 正式实验：
① 制备细胞悬液铺 96 孔板。

• 贴壁细胞要消化充分（可以稍过一点点），这样不需要用力吹打就可以让细胞分散得很好；如果消化不完全，就要用枪用力吹打，使细胞受到机械损伤，影响实验结果。
• 消化后要做细胞计数，调整到合适的密度（预实验摸索到的细胞接种量）。
• 铺 96 孔板：
  △ 要铺均匀，先在每孔中加 50ul 完全培养基（可以在孔中形成液体的表面张力，使后面接种的细胞分散开），再向各孔加 50ul 细胞悬液。这里相当于把细胞稀释了 1 倍，因此前面调整细胞密度时要把细胞密度加倍。
  △ 铺板时注意不时地混匀细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下，保持细胞悬液随时都是均匀状态，尽量保证加到每个孔中的细胞数量都是一致的。
  △ 96 孔板周围一圈孔不加细胞，而是加满 PBS，因为周围孔在培养箱中持续培养的过程中容易蒸发，不适合铺细胞，加 PBS 可以保护被围在中间的孔。
  △ 铺完板后，轻敲板底或用振荡器摇板，帮助细胞分散。

② 37℃培养箱中培养。 转移 96 孔板时，注意尽量端平端稳，一般状态好的细胞 2h 就能贴壁。

③ 加 CCK-8 试剂 10μl/well。细胞贴壁后，加 CCK-8 采集 0 点的数据