TLR4 与 PIEZO1 的作用及 5-羟色胺的影响

Toll 样受体 4（TLR4）作为识别革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的模式识别受体，在维持肠道免疫稳态中扮演重要角色。近期研究发现，TLR4 可通过改变 5-HT 受体表达影响肠道收缩反应，敲除 TLR4 能减弱 5-HT 诱导的结肠收缩，提示 TLR4 与 5-HT 系统可能存在交互调控。此外，机械敏感离子通道 PIEZO1 作为钙内流的关键调控因子，已被证实参与 5-HT 分泌的调节，但其与 TLR4 在肠道动力调控中的相互作用尚未见报道。基于此，本研究聚焦孕期 LPS 暴露对后代小鼠肠道动力的影响，深入探讨 TLR4-PIEZO1 相互作用在 5-HT 介导的肠道动力异常中的作用机制，为理解发育源性肠道功能障碍提供新的理论依据。​

本研究采用体内动物实验与体外细胞实验相结合的策略，系统探究孕期 LPS 暴露对后代小鼠肠道动力的影响及分子机制。动物实验选用 Tlr4-floxed 小鼠与 Villin-Cre 小鼠杂交，构建肠道上皮特异性 Tlr4 敲除（Tlr4△IEC）小鼠模型，将 8 周龄雌性小鼠随机分为四组：Tlr4fl/fl+PBS 组、Tlr4fl/fl+LPS 组、Tlr4△IEC+PBS 组、Tlr4△IEC+LPS 组。于孕 14.5 天腹腔注射 LPS（50μg/kg）或等量 PBS，后代雄性小鼠在 3 周龄时通过尾组织 DNA 进行基因分型，6 周龄时检测肠道动力指标，8 周龄时处死并收集结肠组织用于后续分析。

肠道动力评估采用三种方法：胃肠传输实验通过灌胃 300μL 胭脂红溶液，记录首次排出红色粪便的时间；结肠传输实验将 3mm 玻璃珠从肛门推入结肠 3cm 处，记录排出时间；粪便含水量测定则通过称量新鲜粪便与烘干后粪便的重量差计算。结肠组织形态学分析采用 HE 染色，石蜡切片厚度 5μm，通过 ImageJ 软件量化黏膜层厚度及完整性。​

分子水平检测包括 RNA 测序、Western blot、qPCR 及 ELISA。RNA 测序选取四组小鼠结肠组织，采用 Illumina Novaseq 6000 平台，通过 DESeq2 筛选差异表达基因（fold change>2，P<0.05），并进行 KEGG 通路富集分析。Western blot 检测 TLR4 信号通路相关蛋白（TLR4、CHUK、RELA、p-RELA、PTGS2）及 5-HT 系统相关分子（TPH1、SLC6A4、HTR2C、HTR3A、HTR4），一抗孵育过夜后结合 HRP 标记二抗，通过化学发光底物显影，以 ACTB 作为内参。qPCR 验证关键基因表达，采用 Trizol 法提取 RNA，逆转录为 cDNA 后使用 SYBR Green 染料进行扩增，引物序列参照文献补充表 S1。ELISA 用于检测结肠组织及粪便中 5-HT 含量，严格按照试剂盒说明书操作。​

体外实验选用人肠嗜铬细胞瘤细胞系 BON-1，培养于含 5% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中，分为四组：PBS 组、PBS+TAK-242 组、LPS 组、LPS+TAK-242 组，其中 TAK-242（购自 AbMole）预处理 1 小时（终浓度 10μmol/L），随后 LPS 处理 12 小时。免疫荧光染色检测 TLR4 与 5-HT 的共定位，细胞固定后经 0.2% Triton X-100 透化，一抗 4℃孵育过夜，荧光二抗室温避光孵育 1 小时，DAPI 染核后通过共聚焦显微镜观察。钙成像实验使用 Fluo-4 AM 指示剂，记录不同处理组细胞内钙荧光强度变化。共免疫沉淀实验采用 TLR4 抗体结合蛋白复合物，通过 Western blot 检测 PIEZO1 的结合情况，验证蛋白相互作用。​

实验结果显示，孕期 LPS 暴露显著改变 Tlr4fl/fl 后代小鼠的肠道结构与功能，而 Tlr4△IEC 小鼠无明显变化。HE 染色显示，Tlr4fl/fl+LPS 组后代结肠黏膜层厚度显著减少（P=0.0197），完整性受损，而 Tlr4△IEC 小鼠无论是否暴露于 LPS，黏膜层结构均保持完整。肠道动力检测表明，Tlr4fl/fl+LPS 组后代的结肠传输时间显著缩短（P=0.0063），粪便含水量增加（P=0.0001），胃肠传输时间加快（P=0.0149），而 Tlr4△IEC 小鼠的这些指标在 LPS 与 PBS 组间无统计学差异，提示肠道上皮 TLR4 缺失可逆转孕期 LPS 暴露诱导的肠道动力异常。​

分子机制研究发现，孕期 LPS 暴露激活 Tlr4fl/fl 后代小鼠结肠中的 TLR4 信号通路。Western blot 结果显示，Tlr4fl/fl+LPS 组 TLR4 蛋白表达较 PBS 组升高（P=0.0003），下游分子 CHUK（P=0.0046）及 PTGS2（P<0.0001）的表达也显著上调，p-RELA/RELA 比值呈上升趋势，而 Tlr4△IEC 小鼠中这些蛋白的表达在 LPS 处理后无明显变化，且 LPS 暴露与 Tlr4 敲除的交互作用对 TLR4、CHUK 及 PTGS2 的表达有显著影响（P 分别为 0.0012、0.0048、<0.0001）。RNA 测序分析进一步证实，Tlr4fl/fl+LPS 组中 TLR4 信号通路及 5 - 羟色胺能突触通路相关基因显著富集，热图显示 TLR4 及 5-HT 相关基因簇表达上调，而 Tlr4△IEC 小鼠中无此现象，qPCR 验证发现 Htr4、Reg4 及 Sypl2 等基因的 mRNA 表达变化与测序结果一致，表明 TLR4 可能通过调控 5-HT 系统影响肠道动力。​

5-HT 系统检测结果显示，孕期 LPS 暴露导致 Tlr4fl/fl 后代小鼠结肠及粪便中 5-HT 含量显著增加（P<0.0001 及 P=0.0092），而 Tlr4△IEC 小鼠无明显变化。Western blot 显示，Tlr4fl/fl+LPS 组中 5-HT 合成限速酶 TPH1 表达上调（P=0.0192），转运体 SLC6A4 表达下调（P=0.0139），同时 5-HT 受体 HTR2C（P=0.0014）、HTR3A（P=0.0412）及 HTR4（P=0.0019）的蛋白水平显著升高，且这些变化均依赖于 TLR4 的表达，提示 TLR4 可能通过促进 5-HT 合成、减少重吸收及上调受体表达增强 5-HT 介导的肠道动力。​

体外实验进一步揭示 TLR4 与 PIEZO1 的相互作用机制。BON-1 细胞经 LPS 处理后，TLR4 与 PIEZO1 的 mRNA 表达显著上调（P=0.0004 及 P=0.0273），免疫荧光显示两者共定位增加，共免疫沉淀证实蛋白相互作用增强。钙成像实验表明，LPS 处理诱导明显的钙内流，而 TAK-242 预处理可显著抑制这一效应。ELISA 检测发现，LPS 组细胞上清中 5-HT 浓度升高（P=0.0078），TAK-242 可逆转该变化，提示 TLR4 通过与 PIEZO1 结合促进钙内流，进而刺激 5-HT 分泌。此外，孕期 LPS 暴露使 Tlr4fl/fl 后代小鼠结肠黏膜中 PIEZO1 的表达显著增加（P=0.0001），而 Tlr4△IEC 小鼠中无此现象，证实 PIEZO1 的上调依赖于肠道上皮 TLR4 的表达。​

综合以上结果，本研究证实孕期 LPS 暴露通过激活后代小鼠肠道上皮 TLR4，促进其与 PIEZO1 结合，增强钙内流导致肠嗜铬细胞分泌 5-HT 增加，同时通过上调 5-HT 受体表达增强肠道动力，最终引发肠道蠕动异常。这一机制为理解发育源性肠道功能障碍提供了新的视角，提示 TLR4-PIEZO1-5-HT 轴可能成为改善相关肠道动力异常的潜在靶点。需要注意的是，本研究仅关注雄性后代，且未探讨钙非依赖的 5-HT 分泌途径，未来研究应进一步验证雌性小鼠中的作用及其他可能的调控机制。在实验过程中，AbMole 的 TAK-242 作为特异性 TLR4 抑制剂，为体外验证 TLR4 的功能提供了可靠的工具，确保了实验结果的准确性。