RNA-seq分析(Fastqc+Trimmomatic+STAR+HTseq-count+DESeq2)

最新推荐文章于 2025-02-27 15:30:10 发布
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分类专栏： RNA-seq 文章标签： RNA-seq
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版权

最近做RNA-seq，正好把流程整理下，也希望分享和相互学习。
具体将以Fastqc + Trimmomatic + STAR + HTseq-count + DEseq2的流程来进行。

查看数据完整性

for dir in `ls`; do cd $dir; md5sum -c MD5_*txt; cd ..; done

预处理

FastQC + Trimmomatic

fastqc -t 5 sample_R1.fq.gz
fastqc -t 5 sample_R2.fq.gz
java -jar ~/tools/Trimmomatic/Trimmomatic-0.36/trimmomatic-0.36.jar PE -threads 20 sample_R1.fq.gz sample_R2.fq.gz -baseout sample_filtered.fq.gz ILLUMINACLIP:~/tools/Trimmomatic/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 HEADCROP:8 MINLEN:36 HEADCROP:15

fastqc后发现有些样本per tile sequence content 1，Per base sequence content，Adapter Content，Km

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RNA-seq数据分析（分析策略，比对，转录组组装，转录本定量）
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03-13 6600
分析策略通过综合分析RNA-seq分析流程中不同步骤的工具性能发现不同的分析工具和方法对分析结果的准确度和分析时间影响巨大。HISAT2表现出最快的速度和最准确的拼接比对，但是没有STAR的敏感度高。StringTie在速度和准确度上都优于Cufflinks。长读段方法如IDP和Iso-Seq会识别许多短读段技术没有识别到的多外显子转录本，但是会丢失一些单外显子转录本。通常，在从头组装工具中，Oases表现最佳。不经过比对的工具如和kallisto。
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前言 在用trim_galore进行trimming后，要进行RNA-seq分析的核心部分：mapping 实验室一直购买着CLC Genomics Workbench的版权，用户友好，使用简便，但一年大概要花费30万日币左右，这次挑战用完全免费的Linux+STAR来建立index进行mapping，减少实验开支。
RNA-seq【分析记录】
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08-27 2291
视频学习笔记 概述 预处理 FASTQC数据质控 数据过滤Trimmomatic 有参转录组序列比对 不同比对软件的比较 常用序列比对算法 基因组比对 STAR hisat2 转录本比对 RSEM 无参转录组 转录本从头拼接原理 拼接方法 Trinity 表达定量 RNA-seq常用统计定量单位 基因组比对 Htseq-Count FeatureCount 转录本比对 RSEM 数据分析 思路？ 差异表达 + Deseq标准化原理 富集分析 + GO + 通路富集分
R语言DESeq2进行差异表达基因分析
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02-27 263
读取文件就可以进行差异表达基因分析，替换文件名和分组名。
STAR对RNA seq进行map
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10-10 1981
STAR 本文出自于http://www.bioinfo-scrounger.com 第一次听说START这款比对软件是因为其是ENCODE计划的御用软件，ENCODE计划(ENCyclopedia Of DNA Elements)又称人类基因组DNA元件百科全书计划，是2003年在人类基因组计划完成之后紧接着的又一个大型国际科研项目。 第二次听说则的由于Gaining compre...
STAR: 速度超快的 RNA-seq aligner
菠萝西斯的博客
05-12 6461
文章目录STAR for ENCODE TranscriptomeSTAR 的算法1. Seed search2. Clustering, stitching and scoringSTAR 的用法：构建 indexAlignment STAR for ENCODE Transcriptome STAR 全称是Spliced Transcripts Alignment to a Reference (STAR)，直白的说，就是用后缀数组算法做转录组的比对（Spliced Transcripts == 剪.
「RNA-seq分析软件」RNA-seq比对工具STAR学习笔记
xuzhougeng blog
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使用STAR进行RNA-seq数据比对
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04-18 3550
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RNA-seq Review：RNA-seq数据分析
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文献：RNA-seq数据分析最佳实践调查 本次阅读Genome Biology杂志2016年Online的RNA-seq数据分析方法的Review论文，题目为： A survey of best practices for RNA-seq data analysis 本文翻译来自该文章。 RNA是基因组和蛋白组的中间体，因此转录本的鉴定和定量是重要的生物学问题。该论文综述了RNA-seq项目中相关的各个步骤、每个步骤的局限、和其他组学的整合以及展望。 Note ： 从摘要中可以发现本文综述分为两部分（1）现
RNA-seq(1) :用conda安装RNA-seq所需要的工具-学习笔记
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这篇文章算是对下面若干篇主要参考资料的补充。也是本人在经历四个下午之后终于完成的第一步的一点记录。 之前我用cufflink系列进行了一次RNA-seq分析，这一次是在学习了一种新的分析方法。在整个过程中，也参照了一些生信宝典公众号（这真的对于生信小白来说很nice，强烈推荐）的许多知识。 conda的安装与使用（2019-6-28更新） conda 安装RNA-Seq所需软件 R...
Bulk RNA-seq（类器官）
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10-07 1170
这种方法中提供了整个细胞群体的平均表达谱，也就是说基因表达水平代表的是整个细胞群体的平均水平，这对于在不同组织、条件或时间点之间鉴定差异表达基因非常有用。将细胞单个分离并提取其RNA。选择合适的测序样本、提取总RNA、富集非核糖体RNA、逆转录RNA为cDNA、构建片段文库、在高通量测序平台上进行测序、产生长度为30-300碱基对的单端或双末端读数、读数对比与组装、下游分析。Bulk RNA-seq无法区分个体细胞之间的基因表达差异，并且可能掩盖了罕见细胞群体、微小的转录差异或基因表达随时间变化的差异。
deseq2手册
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DESeq2 的最新manual （Nov. 2014）
探索STAR：高效准确的RNA-seq比对神器
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探索STAR：高效准确的RNA-seq比对神器 STAR RNA-seq aligner 项目地址: https://gitcode.com/gh_mirrors/st/STAR 是一个开源的生物信息学工具，...
基因差异表达分析——基于RSEM对比，DESeq2操作实例
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使用DESeq2的两点要求： DEseq2要求输入数据是由整数组成的矩阵。 DESeq2要求矩阵是没有标准化的。 下面是基本流程： 一、准备工作： 确定工作路径，以确保上传文件时无误 getwd() #显示当前工作目录 setwd() #设置工作目录 操作实例： > getwd() [1] "C:/Users/Larkin/Documents" > setwd("C:/Use...
基因表达差异分析R工具包DESeq2的详细使用方法和使用案例
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DESeq2是一种常用的差异表达基因分析工具，可用于RNA-seq数据的差异表达分析。下面是DESeq2的详细使用步骤和全部脚本示例。
Linux系统下RNA-seq分析（2.STAR比对和cufflinks拼接）
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提示：这里对文章进行总结：例如：以上就是今天要讲的内容，本文仅仅简单介绍了pandas的使用，而pandas提供了大量能使我们快速便捷地处理数据的函数和方法。
RNA-Seq HISAT+ HTSeq + DESeq2流程 及测序深度和质控问题讨论
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数据基于BGISEQ500 SE50 clean data约1.XG，20+M reads。 SE50 20M是否够？ 对基因定量足够。理由：1，测序饱和度（随reads数增加，检测到的基因数随之上升。但当测序量达到一定区间后，基因数变化不明显）。 2，如果要检测isoform等信息，需要PE150或PE100（6G数据），但仅仅定量SE50 20M已经够了。1，FastQC质控 FastQC -t 2 XX.fq.gz ’per base sequence content’几乎每个样本前15碱基
第二章 RNA-seq一般分析流程全套
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提前申明：该贴参照于https://www.jianshu.com/p/e8cd62ba14fe 标题1. 用conda安装RNA-seq所需要 #启动conda自设环境 conda activate python3 或者用 source activate python3 #安装所需软件(conda可以同时安装多个软件，但是建议初学者还是选择逐一安装，避免出现错误) conda inst...
c语言处理rna序列,RNAseq 完整操作流程以及后续例子操作
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05-22 1233
2.软件以及流程以及代码： 本实验使用常规的Tophat2 比对(1)样本制备、建库：总RNA ---> polyA富集mRNA ---> 打断 ---> 随机引物反转录成cDNA ---> 末端修复、加A、加接头RNA提取：方法-使用trizol-based方法或者试剂盒方法；富集mRNA，除去rRNA等RNA:依据为-在测mRNA过程中，首先要去除rRNA。以人为例，在...
RNA-seq分析详细流程
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03-25
<think>好的，我现在需要帮助用户了解RNA-seq数据分析的完整流程，包括步骤和工具推荐。首先，我得回顾自己掌握的知识，并确保符合用户提到的系统级指令，比如正确使用LaTeX格式、生成相关问题等。 用户的问题是关于RNA-seq分析的详细流程，步骤和工具推荐。我需要先理清整个流程的大致步骤，从数据准备到下游分析，每一步需要什么工具，以及注意事项。同时，用户提供的三个引用资料可能涉及具体步骤和工具，比如引用2提到的STAR和FeatureCounts，Fastqc，引用3中的文件夹结构和一些分析步骤。需要结合这些信息来组织回答。 首先，我应该按照典型的RNA-seq流程来分步骤说明。通常流程包括：数据准备、质量控制、数据过滤、比对、定量表达、差异分析、功能注释等。每个步骤需要对应的工具，比如FastQC用于质量控制，Trim Galore或Trimmomatic进行过滤，STAR或Hisat2进行比对，FeatureCounts或HTSeq-count进行定量，DESeq2或edgeR用于差异分析，然后进行GO/KEGG富集分析等。 需要检查用户提供的引用内容，确保提到的工具和步骤被涵盖。例如，引用2提到STAR+FeatureCounts的组合，引用3中提到了Salmon和Hisat2，还有文件夹结构的准备。这些都需要整合到回答中。 同时，要注意回答的结构，分步骤说明，每个步骤的要点和工具推荐。可能还需要注意事项或常见问题，比如质量控制的重要性，比对工具的选择依据，差异分析工具的比较等。 然后，生成相关问题部分需要考虑用户可能进一步想知道的内容，比如各步骤的详细参数设置、工具之间的比较、数据可视化方法、处理大数据时的优化策略等。需要确保问题覆盖用户可能感兴趣的扩展方向。 另外，要确保符合系统级指令中的格式要求，比如行内数学公式用$...$，独立公式用$$...$$，但RNA-seq流程可能较少涉及数学公式，不过如果有统计方法如差异表达中的p值计算，可能需要提到，比如DESeq2使用的负二项分布模型，此时可能需要使用LaTeX公式，例如：差异表达分析可能涉及计算$p$值，并通过多重检验校正得到$q$值[^1]。 还要检查是否有需要单独成段的公式，如果有的话使用$$...$$格式。不过RNA-seq流程可能更多是步骤和工具，数学公式可能不多，但如果有必要的话要正确应用。 最后，确保回答使用中文，结构清晰，引用标识自然添加在引用的内容末尾。例如，当提到数据质控步骤时，可以引用引用2中的Fastqc步骤，或者在提到文件夹结构时引用引用3中的内容。 总结起来，回答的结构应该是： 1. 准备工作（文件夹结构，引用3） 2. 质量控制（Fastqc，引用2） 3. 数据过滤（Trim Galore/fastp，引用3） 4. 比对（STAR/Hisat2/Subjunc，引用2和3） 5. 定量（FeatureCounts/Salmon，引用2和3） 6. 差异分析（DESeq2/edgeR/limma） 7. 功能分析（clusterProfiler） 8. 注意事项（数据备份、版本控制、参数优化） 9. 工具推荐表格 10. 相关问题 每个步骤中需要提到工具、作用、可能的注意事项，并适当添加引用。例如，在数据准备阶段，引用3提到建立文件夹结构的重要性，可以引用；在定量阶段，引用2提到FeatureCounts，可以加上引用标识。 现在需要组织这些内容，确保流程逻辑正确，工具推荐合理，并自然插入引用。同时，生成的相关问题要覆盖流程的优化、工具比较、扩展分析等方向。</think>### RNA-seq数据分析完整流程及工具推荐 RNA-seq分析流程可分为**上游分析**（数据质控与预处理）和**下游分析**（表达量与生物学解释）两大部分，以下为详细步骤及工具推荐： --- #### 一、上游分析：数据准备与预处理 1. **准备工作（文件组织）** 建立标准化文件夹结构，便于管理原始数据、中间文件和结果，例如： ```bash mkdir -p data/rawdata data/cleandata/trim_galore mkdir -p Expression/featureCounts Mapping/Hisat2 ``` 强调版本控制和备份原始数据[^3]。 2. **质量控制（Quality Control）** - **工具**：`FastQC`（可视化质控报告）、`MultiQC`（整合多样本报告） - **目的**：检查测序数据质量（如碱基质量分布、GC含量、重复序列比例）[^2]。 3. **数据过滤与修剪** - **工具**：`Trim Galore`（基于Cutadapt的自动修剪）、`fastp`（高通量过滤） - **操作**：去除低质量碱基（如Phred评分<$20$）、接头序列、N碱基过多片段。 4. **序列比对（Alignment）** - **工具选择**： - 基因组比对：`STAR`（快速长读长）、`Hisat2`（内存高效） - 转录组比对：`Subjunc`（支持可变剪切） - **输出**：BAM/SAM文件，需用`samtools`排序和去重。 --- #### 二、下游分析：定量与生物学解释 5. **表达定量（Quantification）** - **基于比对的方法**： - `FeatureCounts`（计数基因区域 reads） - `HTSeq-count`（灵活处理重叠区域） - **无比对的方法**：`Salmon`（快速转录本丰度估计）。 6. **差异表达分析** - **工具**： - `DESeq2`（基于负二项分布，适用于复杂设计） - `edgeR`（高效处理小样本） - `limma-voom`（适用于log转化后的数据） - **关键输出**：差异基因列表（$|\log_2(\text{FC})| >1$且$q\text{-value}<0.05$）[^1]。 7. **功能富集分析** - **工具**：`clusterProfiler`（GO/KEGG富集）、`GSEA`（基因集富集） - **可视化**：`ggplot2`绘制富集条形图或气泡图。 --- #### 三、注意事项 - **数据备份**：原始数据不可修改，中间文件建议压缩存储。 - **版本控制**：记录软件版本（如`STAR --version`）和分析参数。 - **计算资源**：比对步骤需较高内存（如STAR建议≥32GB）。 --- #### 工具推荐对比表 | 步骤 | 推荐工具 | 特点 | |---------------------|-----------------------------------|--------------------------------| | 质量控制 | FastQC + MultiQC | 可视化直观，支持多样本整合 | | 序列比对 | STAR（基因组） / Salmon（无比对）| 平衡速度与准确性 | | 差异分析 | DESeq2 | 统计严谨，支持复杂实验设计 | | 功能富集 | clusterProfiler | 支持多种数据库，集成可视化 | ---
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