Linux系统下RNA-seq分析（2.STAR比对和cufflinks拼接）

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  前言

  一、比对

  1.建立基因组索引

  2.作图

  3.SAM文件处理

  4.比对结果可视化

  二、转录组组装

  1.cufflinks进行重建全场转录本序列

  2.转录本注释文件的比较

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一、STAR比对

首先在NCBI上下拟南芥基因组序列（fasta格式）文件和基因组注释文件（GTF格式）。

开启共享文件夹功能，在windows系统中将下载的文件放入共享文件夹中，共享文件位置在/mnt/hgfs/fold name,fold name即在windows系统中共享文件夹的名称。

1.建立基因组索引

使用STAR进行基因组索引拟南芥基因组序列（fasta/fna格式，fna文件可直接改名fa）文件和基因组注释文件（GTF格式）。

确保提前进入rna环境。该程序会比较吃内存，保证虚拟机内存至少为8G.

conda activate rna
STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir /home/lumino/TEST1/STARoutput2 --genomeFastaFiles /home/lumino/TEST1/GCA_000001735.2_TAIR10.1_genomic.fa  --sjdbGTFfile /home/lumino/TEST1/genomic.gtf --sjdbOverhang 99  --genomeSAindexNbases 12

1. STAR：这是运行 STAR 工具的命令。

2. --runMode genomeGenerate：这是指定 STAR 运行的模式，即生成基因组索引。

3. --/home/lumino/TEST1/STARoutput2：这是指定生成的基因组索引文件的输出目录路径。您需要将 /home/lumino/TEST1/STARoutput2 替换为您希望保存索引文件的实际路径。

4. --genomeFastaFiles /home/lumino/TEST1/GCA_000001735.2_TAIR10.1_genomic.fa：这是指定包含基因组序列的 FASTA 文件的路径。您需要将 /home/lumino/TEST1/GCA_000001735.2_TAIR10.1_genomic.fa 替换为您实际的基因组序列文件路径。

5. --sjdbGTFfile /path/to/annotation.gtf：这是指定包含注释信息的 GTF 文件的路径。您需要将 /home/lumino/TEST1/genomic.gtf 替换为您实际的注释文件路径。

6. --sjdbOverhang 99：这是指定用于比对的 reads 的长度减去 1。在这个例子中，100 表示 reads 的长度减去 1 为 99。这个参数的设置会影响 STAR 的比对效果。

7. --genomeSAindexNbases 12  推荐的参数，默认为14，但可能对这个基因组大小来说太大。

8. 完成后在文件夹内生以下文件。

2.作图

使用STAR对SRR3418005-filtered.fastq文件进行比对和基因组定位。

确保内存大于12G（很重要），新建一个STAR_result的文件夹。

STAR --genomeDir /home/lumino/TEST1/STARoutput2 --readFilesIn /home/lumino/TEST1/SRR3418005-filtered.fastq --runThreadN 4 --outSAMstrandField intronMotif --sjdbGTFfile /home/lumino/TEST1/genomic.gtf  --outFileNamePrefix /home/lumino/TEST1/STARoutput2/STAR_result/SRR3418005-filtered-STAR

• --genomeDir /home/lumino/TEST1/STARoutput2: 指定STAR索引文件的目录路径。
• --readFilesIn /home/lumino/TEST1/SRR3418005-filtered.fastq: 指定要比对的fastq文件路径。
• --runThreadN 4: 指定使用的线程数为4，用于加速比对过程。
• --outSAMstrandField intronMotif: 指定输出的SAM文件中包含intron motif信息。