定量冷冻喷雾技术进展

医疗设备：证据与研究 2017:10 29–41

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http://dx.doi.org/10.2147/MDER.S124098

计量冷冻喷雾™：一种新型的均匀、可控且一致的体内液氮低温喷雾应用

摘要 ：本文介绍了一种新型的冷冻疗法，该方法采用均匀、可控且一致的体内液氮（LN2）喷雾，称为定量冷冻喷雾™（MCS）过程。尽管MCS可用于多种潜在的临床应用，但本文重点介绍其发展历程，即如何实现径向液氮2制冷剂喷雾的可控且一致的输送，以产生均匀的环周效应，以及如何调节MCS的用量，以特异性消融患者管腔（如气道或食管）内的靶向病变。

关键词 ：定量冷冻喷雾™，冷冻消融，再生性愈合，LN2喷雾冷冻治疗

引言

几十年来，皮肤科医生一直使用低温冷冻和再生性愈合技术。自从液氮（LN2）首次用于人体体表治疗以来，已发表了大量关于其制冷应用的同行评审医学文章。这些应用通常包括将LN2或其他制冷剂喷雾到皮肤病变部位（例如痣），以消除该病变，并随之发生带有极少或无瘢痕的再生或修复性愈合过程。

最近，病变和疾病的低温消融已发展到体内应用（例如，Liapi 和 Geschwind6）。常见的方法包括使用冷冻探头7或针8,9，将其直接接触靶组织。这些冷冻探针通常使用压缩气体，如氩气、一氧化二氮或二氧化碳，让其迅速膨胀进入一个封闭空间，通常是冷冻外科设备的尖端。根据焦耳‐汤姆逊（J‐T）效应10，压缩气体的温度显著下降，从而冻结邻近组织；这些设备通常可达到−40°C 至 −89°C，而一些基于液氮（LN）2的冷冻针可达到−160°C。J‐T 过程使这些制冷剂能够消融从良性到恶性的各种组织，并在数分钟至数十分钟内实现对靶组织的缓慢冷冻。从正常体温冷却至0°C 的初期会减缓细胞代谢11。当温度继续从0°C 降至−20°C 时，细胞外环境开始形成冰晶。结果，细胞内的自由水通过渗透作用被抽出细胞，进入部分冻结的细胞外介质，导致细胞脱水和收缩。这也可能因脱水效应而导致细胞死亡（图1）。

与其他将制冷剂保留在封闭探头或针头内的制冷剂设备不同，CSA医疗公司率先在体内使用液氮喷雾来通过将冷冻导管置入内窥镜的工作通道，可实现对胃肠道12,13和上呼吸道14–16内的病变（即良性、癌前及恶性病变）和狭窄进行消融。该公司的专有且已商业化的医疗器械——truFreeze系统®（CSA医疗，美国马萨诸塞州列克星敦）采用计算机驱动的方法和装置，将液氮从控制台内的杜瓦瓶经导管输送至患者体内，使液氮直接喷洒到靶组织上17。喷洒出的液氮温度为−196摄氏度，作用于组织后，在细胞脱水发生之前迅速导致病变组织闪冻，并形成细胞内冰晶（图1）18。这些冰晶在恢复（解冻）阶段进一步聚集，破坏线粒体和内质网等细胞器，而细胞壁保持完整。这些产能细胞器的破坏导致细胞死亡。消融的死细胞失去细胞连接或发生凋亡，随后被再吸收、崩解或从膜壁“脱落”，从而排出体外。液氮2喷雾治疗后，组织以再生方式愈合，几乎无瘢痕或无瘢痕形成。

与之形成鲜明对比的是热消融方式，如射频、博维电刀、激光和氩气等离子凝固。这些消融应用会引起组织热固定，导致细胞和蛋白质变性，进而引发细胞壁破裂，使细胞内蛋白暴露于免疫系统，从而引发修复性愈合，其特征是纤维化瘢痕。19

与典型的消融性冷冻外科工具一样，truFreeze系统允许医生确定制冷剂输送的速率和总持续时间。医生根据待处理异常组织的特征来决定制冷剂的应用时长。

CSA医疗公司正在持续推进液氮2在各种医学应用中的再生效应，例如在气道或食管等管腔内使用径向喷雾。为了有效消融并可能治疗患者气道或食管内的特定良性或恶性疾病或组织，必须向靶区输送预设且一致的量的环周液氮2制冷剂喷雾，以安全有效的方式实现冷冻消融和组织愈合效果。这种液氮2喷雾技术被命名为“计量冷冻喷雾™”（MCS）。本文以下部分将描述MCS方法的总体考虑、测试方法和结果，以及MCS的解剖学考虑。

MCS技术考虑

开发方法

MCS的开发阶段围绕建立用于评估MCS冷却性能的测试夹具和方法而展开。该过程遵循一个四步法（图2）。首先，采用数值模拟来估算MCS对人体组织以及包括弹道凝胶和高温无毒（HTNT）凝胶在内的组织模拟凝胶的影响。HTNT凝胶是一种由水、山梨醇、淀粉、磷酸氢二钠和ι‐卡拉胶组成的水凝胶，其设计为在远高于37°C的温度下熔化，以模拟人体温度。该模型基于从文献中获得的特性20,21，以及黏膜组织和凝胶模拟物在冻结和未冻结状态下的差示扫描量热法（DSC）和导热系数测量结果构建而成。随后，利用凝胶通过视觉判断合适的径向喷头结构，以产生带有环周效应的均匀喷雾，在一定范围内实现

数值模拟

为了了解HTNT凝胶测试夹具中产生的温度在预测使人体组织消融至特定深度所需液氮2量方面的相关性，必须确定我们的猪模型支气管壁人体组织替代物和HTNT凝胶模型的热性能。从当地肉类加工厂（美国马萨诸塞州西格罗顿血品农场）获取recently 屠宰猪的猪支气管组织后，将支气管上皮从软骨壁上分离出来。该组织样本以及一份HTNT凝胶代表性样品被送至分析答案公司（美国马萨诸塞州沃本），该公司依据ASTM E1269标准采用差示扫描量热法（DSC）对两种样品的热性能进行了研究。

然后，在COMSOL软件（一种有限元分析软件包）中建立了二维轴对称热流体模型23。基于此项工作，创建了两个模型：一个用于人支气管组织，采用测试猪支气管组织热性能所获得的数据（表1）；另一个用于HTNT凝胶（表2）。在管腔内部表面边界条件上采用了对流换热模型。组织模型使用彭乃方程，并包含与相变和结晶相关的潜热，以及代谢率和灌注率。凝胶模型则被模拟为带有温度依赖性特性的固体，并考虑相变。随后，将MCS输送至嵌有热电偶的HTNT凝胶表面，热电偶位于特定深度（即0.25、

建立径向喷头几何结构

为了在不同直径的管腔壁上均匀地产生向外的径向LN2喷雾，最好使用单一的径向模式。然而，对于直径和长度较大的管腔（如食管或气管），多排设计被证明在产生均匀且一致的LN2喷雾方面更为有效。对导管尖端多种导管孔型（图3）进行了评估，以表征喷雾输出情况。测试矩阵包括在由弹道凝胶制成的三种内径管腔模型中各进行两次LN2喷雾，以观察冷冻区域（包括径向均匀性）

以及冷冻区域的深度和长度）；使用特定测试夹具对三次LN2喷雾的流速和输送功率进行测量；以及对管腔温度变化速率、喷雾均匀性和达到的最终温度进行测量。

图4显示了在18毫米管腔（用作医学上相关最大气道管腔直径之一的参考点）中对其中一种孔型配置进行测试的结果。该样品在所有相关管腔直径的不同象限中均产生了均匀的环周冷冻区域。其他样品未达到相同的均匀喷雾效果。

为了测量管腔圆周上的喷雾均匀性、温度变化速率以及达到的最终温度，在选定位置将带有4至240根超细热电偶（0.0025厘米直径）的管腔进行配置（图5）。每个管腔均采用相同的25秒喷雾时间进行喷洒，并重复三次以确认重复性。选择该时间长度是因为无论管腔直径如何，均可实现可检测的热渗透到凝胶中。

图6显示了一个典型的测试结果。可以看出，各个热电偶单元的热分布曲线表现出高度的一致性。

测试完成后，对最优设计进行了有限元分析，以确定最稳健的解决方案。图7显示了典型网格模式

表1 猪气管黏膜的热性能数据（分析答案公司，美国马萨诸塞州沃本）
性质
-------------------------
熔化/凝固温度
熔化潜热
结晶温度
结晶潜热
20°C时的比热容
−20°C时的比热容
20°C时的导热系数
导热系数在−170°C
密度

表2 高温无毒（HTNT）凝胶的热性能数据（分析答案公司，美国马萨诸塞州沃本）
性质
-------------------------
熔化/凝固温度
熔化潜热
结晶温度
结晶潜热
20°C时的比热容
−20°C时的比热容
25°C时的导热系数
−170°C时的导热系数

喷雾特性测试

为了更全面地了解液氮2喷雾条件，进行了额外的喷雾特性表征测试。具体而言，采用了相位多普勒粒子分析仪（PDPA）和LaVision激光片成像仪，以获取有关喷雾特性的更详细数据。这些测试在Spraying Systems公司位于美国伊利诺伊州惠顿的喷雾分析与研究服务部门进行，涵盖了开放式末端喷雾和径向喷雾导管。

相位多普勒粒子分析仪（PDPA，TSI 公司，美国明尼苏达州 Shoreview）通过在喷雾羽流内的多个位置进行点测量，提供喷雾液滴尺寸和速度分布的数据。使用测试装置时，激光点尺寸直径为几微米，该点必须横跨喷雾羽流的边缘，以获取喷雾羽流从边缘到边缘的尺寸、各位置处的液滴尺寸以及每个评估点的速度数据。图8显示了使用径向喷雾导管测试期间拍摄的图像。

为了捕捉喷雾轮廓的完整范围，选用了两个距离，这两个距离与现有7.8毫米和9.8毫米的人体管腔直径相近。通过观察液滴速度和观测到的液滴数量的减少来确定喷雾边缘。通常，在喷雾边缘，数据速率从30秒内的>10,000个液滴减少到相同时间段内的~500个液滴。

相位多普勒粒子分析仪检测了DV0.1、DV0.5、DV0.9和D32直径，这些参数用于表示喷洒的液氮体积对应的液滴尺寸（表3）。DV0.1是值，其中10%的喷洒液氮2总体积（或质量）由直径小于或等于该值的液滴组成；DV0.5是中值体积直径，其中50%的喷洒液氮2总体积由大于中值直径的液滴组成，50%由小于中值直径的液滴组成；而DV0.9是90%的喷洒液氮2体积由直径小于或等于该值的液滴组成。D32是索特平均直径，用于以喷雾产生的表面积来表示喷雾的细度。它是具有与所有液滴的总体积与总表面积之比相同的体积‐表面积比的液滴直径。

直喷导管与径向喷雾导管在速度和整体液滴尺寸上存在显著降低。这是由于液氮在出口前突然改变方向时，导管内剪切作用所致。这些测量结果表明，径向喷雾导管可提供更扩散且可控的喷雾，因此有望更有效地对带有较小直径管腔的身体精细区域进行喷雾。

图9显示了在两次不同的测试运行中，末端喷雾导管在喷雾羽流不同位置处的平均液滴直径（DV0.5）。测试运行的形状和叠加情况表明具有出色的重复性。此外

表3 不同导管类型的液滴尺寸相位多普勒粒子分析仪测试结果
导管类型
--------------------------
直孔开口端
偏移径向孔
线内径向孔

核心探针和腔内压力测试装置

需要一种可重复且可再现的测量系统，用于评估液氮2冷冻喷雾输出，以满足设计验证测试的要求。此类测量系统能够以必要的置信度评估部件间的差异，从而确保数据的一致性和稳定性。为此设计了核心探针夹具和腔体压力夹具，分别用于测量制冷剂输送总性能（定义为在MCS时间和温度条件下控制的系统总冷却能量输出）以及液氮2转化为氮2过程中冷冻喷雾产生的压力。图11显示了核心探针的示意图和标准测试设置的照片。核心探针包含一个具有已知质量和热传导特性的圆柱体，其内部通过热粘合方式固定有热电偶，用于测量液氮2喷雾期间传递到探头的总能量。导管（通常用于内窥镜的工作通道）安装在加热水套（37°C）内，以模拟在体腔中进行液氮2喷雾的情况。

图12显示了腔内压力测试装置的示意图表示。该设备由一个带有计量阀和压力传感器的已知体积组成，用于确定在受控液氮喷雾过程中以及随后转变为氮气时的腔内压力。该方法允许评估液氮喷雾产生的氮气压力，作为压力代理指标，以评估在人体体内使用过程中可能出现的最严苛条件。这些测试证实，对于持续时间为<25秒的定量冷冻喷雾，最大腔内压力保持在40 cm H2O以下，并证明从压力角度来看，MCS可在人体的食管或气道管腔中安全使用。24

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猪动物模型测试

在MCS的开发过程中，HTNT凝胶研究中的结果与猪动物模型体内测试的发现进行了对比。为了确定低温消融效应在支气管管壁中渗透的深度，在治疗后对切除的支气管组织进行了活性染色。活性染色基于以下原理：可通过一种反应将无色盐转化为有色甲臜色素，从而识别热诱导组织坏死区域，该反应仅在存活组织中发生。此过程使用两种化合物：1）氯化三苯基四氮唑（TTC），以及2）硝基蓝四氮唑（NBT）。这两种化合物均利用脱氢酶辅酶反应，在存活组织中实现完全颜色变化（TTC由无色变为红褐色，NBT由无色变为蓝黑色），或在混合活性组织中产生部分颜色变化（TTC由无色变为粉红色，NBT由无色变为灰色）。缺乏完整酶活性以代谢这些盐类的非存活或坏死组织不会被染色。TTC染色最适合宏观上检测热坏死及其与存活组织的边界；NBT染色最适合微观上检测热坏死及其与存活组织的边界。19,22图13显示了通过NBT染色观察到的正常组织与冷冻喷雾处理后组织的比较。

在设计阶段结束时，使用最终的MCS控制参数评估了一系列短期存活的猪动物研究（体内MCS治疗完成后<1 h至安乐死和组织切除）。终止温度控制了喷雾用量与测量气道直径之间的关系（图14），并实现了足够的组织消融深度，从而在体内验证了测试夹具生成的数据。

此外，动物测试还发现了一个潜在的变量（工作通道内的黏液或其他液体），内窥镜的变化是冷冻喷雾过程中流动焓变化的一个来源，可能会影响MCS控制算法，导致达到最低目标温度（由导管上的热电偶测量）的时间延迟。通过引入最大时间限制，并结合经验选定的边界条件（导管热电偶温度数据线性曲线拟合的斜率和R2值），可自动检测并终止在支气管镜工作通道中存在过量物质的定量冷冻喷雾，提示用户干预。已证明一种内窥镜清洁技术能够有效清除内窥镜中的过量物质，有助于后续喷雾的成功实施。

尽管由于切片方法导致病理学发现在一定程度上存在差异，但许多经LN2冷冻喷雾处理的猪气道切片显示出在0.1–0.5毫米的最佳目标深度范围内达到环形至近环形效应，该结果通过最终经验开发的MCS实现。

导管温度相关性

完成了一系列测试，以确定导管温度与导管能量输出之间的相关性。固定在导管远端的热电偶用于测量导管温度随喷雾时间和管腔尺寸的变化情况。这些测量结果表明，终端温度（即不锈钢导管壁的净能量移除）与输送到靶向消融区域的液氮2量之间存在强烈且直接的关系。图14显示了管腔直径与导管末端温度之间的关系。通过导管热电偶测得的选定终端温度以及冷却变化速率，由于冷却输送性能（能量输出），在猪支气管组织中产生了期望的效果。

当控制算法建立后，对损伤长度、损伤深度（DOI）以及径向模式分布的均匀性进行了评估。如前所述，总体目标是证明MCS在不同直径和长度的管腔中实现了稳定、均匀且呈环周分布的液氮喷雾，从而产生的消融深度（DOIs）处于预期范围内（出于研发目的，使用了0.1–0.5毫米的目标损伤深度范围；然而，控制系统可调整以达到在制冷剂输送能力范围内任何临床所需的损伤深度）。针对多个管腔尺寸：6、8、12 和 18 毫米，进行了一系列HTNT凝胶测试。本研究的目的是评估居中的液氮喷雾及其导致的总体损伤深度，以确认用于各种急性动物研究的导管终端温度设置。根据HTNT凝胶与猪支气管组织之间的相关性（通过活性染色验证），不断调整导管热电偶终端温度，直至所产生的损伤深度落在0.1–0.5毫米的边界范围内。图16显示了喷雾持续时间与在0.25毫米处测得的HTNT凝胶最低温度之间的关系。图16中的多项式曲线拟合对应于通过相关数值模拟确定的组织中指定深度处的致死等温线（−20°C）。

通过使用弹道凝胶，完成了一系列带有不同腔体尺寸的补充测试，以确定LN2 MCS导致的损伤长度。结果见表4。

进一步进行了一系列HTNT凝胶测试，以评估在不同标称深度下居中喷雾的损伤长度与其他变量的关系。评估了以下条件：
1. 偏心导管：从中心到管腔壁距离的一半（临床使用中的预期变异）；
2. 偏心导管：距管腔壁1毫米（最坏情况）；
3. LN2喷雾2倍过量（误用和/或显著的解剖变异）；
4. 低能量限温度；
5. 最大时间截止；
6. 在8毫米管腔内两次喷雾并回拉1厘米。

针对每种临床相关挑战条件，测量了其长度和消融深度。图17显示了管腔直径为8毫米时的代表性结果。

在导管位于管腔中心的理想和非理想使用条件下，以及模拟临床使用中预期变化的条件下（如导管在管腔中偏心放置和管腔直径的变化）对喷雾效果进行了评估（图18）。观察发现，在导管偏心放置的情况下，温度分布曲线仍能在目标参数内产生环形消融深度。

凝胶测试和动物测试是一个建立两种方法之间关系的迭代过程。该过程得出了所需的MCS参数，以指导算法在组织目标深度处输送可控且均匀的液氮2量。MCS根据管腔直径，自动输送适量的液氮2喷雾，喷雾量由最长喷洒时间或导管温度阈值决定，以先达到者为准。

表4 弹道凝胶损伤测量长度
管腔直径 (mm)
6
8
10
12
18

摘要

本文总结了一种新型冷冻喷雾系统的研发，该系统通过内窥镜的工作通道将导管送入人体，可输送受控的、疾病或组织特异性的以及重复一致的径向液氮喷雾2。与用于一般组织消融的冷冻探针或外部局部液氮2喷雾不同，该系统可用于针对特定疾病状况应用液氮2冷冻喷雾，也可用于清除不需要的组织。该技术的基础在于，由闪冻式液氮2低温消融所引发的再生或修复性愈合。

为了应对特定的疾病状况，LN2冷冻喷雾过程需要新型控制手段，以确保输送量确实一致。将位于喷雾导管远端的热电偶的温度曲线与预期的低温组织治疗相关联的能力，是实现冷冻喷雾控制的关键，该过程已被确定为MCS。这一开发首先需要将靶向人体组织的热特性与基于凝胶的测试装置进行比较和建模。此过程使得后续从基于凝胶的测试装置和核心探针生成的数据得以解释。这种相关性贯穿了整个开发过程。

在将液氮喷洒到内脏系统的过程中，所产生的氮气从被喷洒器官中的安全逸出至关重要。对喷雾冷冻治疗期间器官内部产生的气体压力及其排出过程进行建模，是确保液氮安全应用的关键。通过特定的测试夹具以及对气体逸出模式的分析，已确定了安全的液氮喷雾冷冻方法，使得MCS过程中产生的氮气能够从目标器官安全逸出。

特定器官中产生对异常上皮层所需效应的冷冻消融深度将由疾病过程决定。凝胶和核心探头测试夹具可用于预测MCS的用量，并随后使用猪动物模型记录体内组织效应。该组织模型需要采用特殊的组织染色过程，以识别因冷冻处理细胞无法产生能量而被消融的细胞层。这些活性染色剂会在仍具有活性并能产生能量的细胞内由无色变为特定颜色，而完整但无活性的细胞则不被染色。此类动物研究是预期MCS在人体内效应的最终代理模型。

本报告中提到的测试替代物支持对此方法的安全使用进行周密且系统化的开发。