Fast Q与 fast A

一 基础知识

1.1掌握FASTQ格式
(1)格式有什么特点？
fastq内容格式有4行：
第1行主要储存序列测序时的坐标等信息；
举个例子：
• @ST-E00126:128:HJFLHCCXX:2:1101:7405:1133
• 1. @，开始的标记符号;
• 2. ST-E00126:128:HJFLHCCXX，测序仪唯一的设备名称;
• 3. 2，lane的编号;
• 4. 1101，tail的坐标;
• 5. 7405，在tail中的X坐标;
• 6. 1133，在tail中的Y坐标
- 第2行就是测序得到的序列信息，一般用ATCGN来表示，其中N用于荧光信号干扰无法判断到底是哪个碱基时的代表符号；
- 第3行以“+”开始，可以储存一些附加信息，但目前的测序fastq文件这一行一般是空的。
- 第4行储存的是质量信息，与第2行的碱基序列是一一对应的，其中的每一个符号对应的ASCII值是经过换算的phred值，可以简单理解为对应位置碱基的测序质量值，越大说明测序的质量越好。不同的版本对应的phred值范围不同。
(2) 什么是phred值，怎么计算？
是评估这个bp测序质量的值，测序仪通过判断荧光信号的颜色来判断碱基的种类，ATCG分别对应红黄蓝绿，信号强弱不同，在这种情况下对每个结果的判断的正确性都存在一个概率值，这个值被储存为ASCII码形式，转化方式如下：
将该碱基判断错误概率值P取log10之后再乘以-10，得到的结果为Q。
比如，P=1%，那么对应的Q=-10*log10（0.01）=20（这个计算公式illumina平台使用，Solexa系列测序仪使用不同的公示来计算质量值：Q=-10log(P/1-P)）
把这个Q加上33或者64转成一个新的数值，称为Phred，最后把Phred对应的ASCII字符对应到这个碱基。
如Q=20，Phred = 20 + 33 = 53，53在ASCII码表里对应的ASCII符号是”5”
(3) phred33 与 phred64是什么意思？
质量字符的ASCII值和质量得分的关系有如下两种：可以粗略分为 Phred+33和Phred+64，这里的33和64就是指ASCII值转换为Q该减去的数值。
在处理测序数据时，因为一些软件会根据碱基质量得分的不同做不同的处理，常要指定正确的编码方式，有必要对质量字符与质量得分的关系（Phred+33或Phred+64）作出正确的判断。当然，如果处理的是最近两年产生的测序数据，基本上都是Phred+33的，但从NCBI SRA数据库下载的较早的数据可能不同，需要注意。

1.2 FASTA格式的构成是怎样的，有什么样的规律？
fasta格式用于储存序列，可以储存DNA、RNA和蛋白质序列，一般分为两个部分，第1行是以>开头的序列描述信息，包括数据库中的编号，序列名称，序列类型，剩余的为序列信息,以蛋白质和mRNA序列文件为例:
蛋白质fasta文件
• 以>开头
• sp|P69905 数据库编码
• HBA_HUMAN Hemoglobin subunit alpha 蛋白质名称
• OS=Homo sapiens 所属物种
• GN=HBA1 基因名称
sp|P69905|HBA_HUMAN Hemoglobin subunit alpha OS=Homo sapiens GN=HBA1 MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKLASVSTVLTSKYR`
核酸序列文件（mRNA序列中的U均用T来代替）
• 以>开头
• gi|13650073 基因ID
• gb|AF349571.1 genebank编号
• Homo sapiens hemoglobin alpha-1 globin chain (HBA1) 基因名称
• mRNA, complete cds 序列类型
gi|13650073|gb|AF349571.1| Homo sapiens hemoglobin alpha-1 globin chain (HBA1) mRNA, complete cds CCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGGTGCTGTCTCCTGACGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCT

1.3 什么序列适合用FASTA保存，什么序列适合用FASTQ保存？
单纯的蛋白或者核酸的序列信息一般用FASTA格式保存，而测序文件一般用包含仪器信息和测序质量的FASTQ格式保存。

二 编程操作:

对FASTQ的操作
• 5,3段截掉几个碱基
• 序列长度分布统计
• FASTQ 转换成 FASTA
• 统计碱基个数及GC%

对FASTA的操作
• 取互补序列
• 取反向序列
• DNA to RNA
• 大小写字母形式输出
• 每行指定长度输出序列
• 按照序列长度/名字排序
• 提取指定ID的序列
• 随机抽取序列

高级难度：
• 根据坐标取序列
• 多文件合并
• 根据ID列表取序列
• GTF文件探索
• 简并碱基的引物序列还原成多条序列
• snp进行注释并格式化输出