转录组表达量的常规标准化方法（FPKM、RPKM、TPM）| 生信笔记09

上期我们讲完了转录组的基本原理、实验设计和上游分析，在开始差异基因分析之前，我们先来了解一下常见的RNA-seq的定量方式

主要的标准化方式为：

• RPKM（Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）

• FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped fragments）

• TPM（Transcripts Per Million）

为什么要进行标准化？

• 在测序中，覆盖度往往不同，组与组之间的总表达量往往差异巨大：:在RNA测序（RNA-seq）和基因组测序中，测序深度是指在整个基因组或转录组中，每个碱基被测序的平均次数。

• 测序深度对于确保测序数据的准确性和完整性非常重要。较高的测序深度可以提高检测低表达基因或罕见变异的几率，但同时也增加了测序成本。相反，较低的测序深度可能导致重要生物学信号丢失，因为一些低丰度的转录本或变异可能没有被检测到。

• 在RNA-seq数据分析中，测序深度是评估样本表达量时的一个重要因素，因为它可以影响对基因表达水平的准确估计。在进行不同样本间的表达量比较时，通常需要确保样本之间具有相似的测序深度，以避免因测序深度差异而造成的偏差。

• 越长的基因会有更多的reads比对到上面

RPKM的计算流程

form：25. RPKM FPKM and TPM Clearly Explained_480p_哔哩哔哩_bilibili

1. 首先根据测序深度来scale，想象现将表达量除以总reads数，因为大多数软件都能自动计算，这里就不放具体的计算公式，仅作理解

2. 除以基因长度，这样归一后就可以有一个规范的可比较的基因的表达量

细心的小伙伴，可能会想到：基因表达不是还会有可变剪切吗？这些方法粗暴地直接计算全长转录本的表达量，似乎忽略了这个过程？

当然，我们目前对于不同转录本的功能了解有限，目前最主流RNA-seq的分析就是基于全场转录本的。

感兴趣的小伙伴可以点个关注，我后面更新新的关于识别不同转录本的分析流程。

RPKM和FPKM有什么区别？

• RPKM主要用于单端测序（single-end sequencing）数据，即每个转录本只产生一个读段（read）。

• FPKM主要用于双端测序（paired-end sequencing）数据，这种测序方式会产生成对的读段，每对读段通常来自同一转录本的同一片段（fragment）。

FPKM的计算和RPKM非常类似，使用哪一个却决于使用的测序类型

TPM流程

1. 首先根据基因长度归一（也就是除以基因长度）

2. 再根据总深度归一

是不是看着很熟悉？和RPKM的流程反了一下，但是这么操作有比较深的影响

相比较于RPKM，TPM的表达量在归一之后，每一个重复有着相同的总表达量

作为一种归一方法，TPM可以将结果标准化为比值（这个基因表达量占单个sample的总表达量的比值），被认为是更加准确的归一方法。

但说是这么说，具体选择哪一种方法，还是要参考一下本领域其他文献是怎么操作的。