19、mRNA药物、疫苗与脱细胞组织的生物医学应用

mRNA药物、疫苗与脱细胞组织的生物医学应用

一、mRNA药物和mRNA疫苗

1.1 mRNA简介

信使核糖核酸（mRNA）作为一种新型药物形式备受关注。人工合成的mRNA可作为治疗剂或疫苗注入人体。mRNA疫苗最早用于应对COVID - 19，在降低感染发生率和减轻病情方面效果显著。mRNA具有多种优势，如只需改变核酸序列就能产生任何蛋白质，且插入突变风险极低，因此被广泛应用于各类传染病疫苗、癌症疫苗及治疗剂等领域。

1.2 体外转录（IVT）模板DNA的设计与构建

1.2.1 模板DNA的制备方法

要通过IVT制备mRNA，首先需设计和构建模板DNA。模板DNA通常为线性DNA，可通过质粒DNA（pDNA）的限制性酶切或聚合酶链式反应（PCR）来制备。在使用限制性酶切pDNA制备模板DNA时，应避免使用产生3’突出端的限制性酶（如PstI），因为这类带有3’突出端的模板DNA在IVT过程中易增加副产物。若必须使用此类酶，可用T4 DNA聚合酶将3’突出端转化为平端。II S型限制性酶（如SapI）的切割位点在识别序列之外，可避免在poly(A)尾下游添加额外碱基，有助于提高mRNA的翻译效率。

制备好模板DNA后，需通过琼脂糖凝胶电泳确认其大小。通常使用常规的PCR纯化试剂盒进行纯化，若电泳中发现未消化的pDNA或PCR副产物，则需通过凝胶提取法纯化合适大小的模板DNA。

1.2.2 模板DNA的组成成分

模板DNA包含四个关键成分：启动子、蛋白质编码区、5’和3’非翻译区（UTRs）以及poly(A)尾。
- 启动子 ：模板DNA中的启动子需与IVT中使用的依赖DNA的RNA聚合酶相匹配。例如，使用T7 RNA聚合酶时，模板DNA应包含T7启动子序列。T7、T3和SP6启动子是IVT中常用的启动子，其中T7启动子最为流行。需注意，哺乳动物细胞转录用的启动子（如CAG启动子）通常不适用于IVT。在T7启动子下游插入富含AT的序列（如ATAAT）可能提高转录效率。常见启动子序列如下表所示：
| 启动子 | 序列（转录起始位点下划线标注） |
| ---- | ---- |
| T7（常规） | TAATACGACTCACTATAGGG |
| T7（用于CleanCap AG试剂） | TAATACGACTCACTATAAGG |
| T3启动子 | AATTAACCCTCACTAAAGGG |
| SP6启动子 | ATTTAGGTGACACTATAGAA |
- 蛋白质编码区 ：密码子优化是设计蛋白质编码区的关键。非最优密码子不仅会降低翻译延伸速率，还会影响mRNA稳定性。目前，许多商业人工基因合成服务（如赛默飞世尔科技的GeneArt）提供密码子优化工具。除避免使用非最优密码子外，使用尿苷含量低、鸟苷和胞苷含量高的密码子可降低免疫原性并提高翻译效率。但需注意，过高的翻译延伸速率可能导致蛋白质错误折叠，因此最高翻译延伸速率并不一定能产生最多正确折叠的功能性蛋白质。比较不同密码子使用的mRNA变体时，建议同时评估编码蛋白质的产量和活性。
- UTR ：UTR虽不翻译成蛋白质，但会影响翻译效率和mRNA稳定性。
- 5’UTR ：位于mRNA 5’端与蛋白质编码区起始密码子之间，合适长度为50 - 70 nt。5’UTR中的稳定RNA二级结构会对翻译产生负面影响，其中紧邻起始密码子上游的“GCCRCC”（R = A或G）序列是Kozak共有序列（GCCRCCATGG）的一部分，缺少该序列会导致翻译效率低下。5’UTR中存在上游开放阅读框或上游起始密码子会使翻译从非预期位点开始，因此应避免此类情况。
- 3’UTR ：位于蛋白质编码区终止密码子与poly(A)尾之间，长度不应短于27 nt，过长（如1500 nt）可能降低mRNA稳定性。与5’UTR不同，3’UTR中的稳定二级结构对翻译有积极作用。虽然α - 或β - 珠蛋白mRNA的UTR被广泛使用，但也有一些能提高翻译效率和mRNA稳定性的UTR报道。不过，UTR的适用性可能因细胞类型而异，细胞内源性microRNA和RNA结合蛋白的表达水平不同，这些生物分子的结合会对翻译效率和mRNA稳定性产生正负不同的影响。例如，含有RNA结合蛋白HuR结合位点的3’UTR可增加翻译，而5’或3’UTR中的microRNA结合位点会降低翻译。若已确定转染的目标细胞类型，检查该细胞中高活性的microRNA并从UTR中删除其结合位点，有助于提高翻译效率。
- Poly(A)尾 ：为稳定mRNA，其3’端由poly(A)尾保护，poly(A)尾在翻译中也起重要作用。通过IVT制备mRNA时，有两种添加poly(A)尾的方法：一是IVT后进行酶促聚腺苷酸化，使用poly(A)聚合酶；二是在IVT模板DNA中添加poly(A)尾的模板序列，通过依赖DNA的RNA聚合酶转录生成。酶促聚腺苷酸化法中，IVT模板DNA无需包含poly(A)尾的模板序列，但会增加mRNA制备步骤，且添加的poly(A)尾长度易变。因此，使用含poly(A)模板序列的IVT模板DNA的方法更为常用，该方法能添加长度一致的poly(A)尾。一般来说，poly(A)尾长度为100 - 120个腺苷，较短的poly(A)尾会导致翻译效率降低。有研究表明，300个腺苷的更长poly(A)尾可进一步提高翻译效率，但制备包含如此长poly(A)尾的IVT模板DNA较为困难。通过PCR制备IVT模板DNA时，使用含poly(T)序列的反向引物添加poly(A)尾模板序列，其长度受引物长度限制，市售引物最大长度通常小于200个核苷酸。而通过限制性酶切pDNA制备时，pDNA应包含poly(A)尾模板序列，但这种重复序列在大肠杆菌中易诱导重组，导致poly(A)尾模板序列截断，可通过在poly(A)尾模板序列中插入间隔序列或使用线性pDNA来减少截断情况。

1.3 mRNA的体外转录与纯化

mRNA的制备通常包括五个步骤：IVT、用DNase I消化模板DNA、酶促加帽（必要时进行酶促聚腺苷酸化）、去磷酸化和纯化。
- IVT ：在IVT过程中，以rNTPs（ATP、UTP、GTP和CTP）为底物，通过依赖DNA的RNA聚合酶（如T7 RNA聚合酶）从模板DNA转录生成mRNA。将IVT反应混合物中的未修饰核苷酸替换为修饰核苷酸（如N1 - 甲基 - 假UTP），可转录出含修饰核苷酸的mRNA，这有助于增强翻译并降低免疫原性。UTP常被替换为N1 - 甲基 - 假UTP，该修饰核苷酸也用于COVID - 19疫苗。但需注意，修饰核苷酸的效果会受细胞类型、序列和mRNA递送方法的影响。使用T7 RNA聚合酶时，常规反应时间为4 - 6小时，具体取决于RNA聚合酶类型和反应缓冲液。延长反应时间虽可增加转录mRNA总量，但有时会因RNA聚合酶活性降低而产生较短的mRNA。经典T7 RNA聚合酶的反应温度为37°C，有报道称使用热稳定RNA聚合酶在51 - 55°C进行IVT可减少具有免疫原性的双链RNA（dsRNA）副产物。IVT完成后，需用DNase I或其衍生物消化模板DNA。
- 加帽与聚腺苷酸化 ：mRNA的5’端帽结构对高效翻译和稳定性至关重要。加帽方法有两种：一是IVT后进行酶促加帽，常用痘苗病毒加帽酶，但这种方法加帽的mRNA在帽相邻的第一个核苷酸的2’-O位置无甲基，形成的“cap 0”结构可能诱导mRNA翻译抑制，建议使用2’-O - 甲基转移酶将其转化为“cap 1”；二是使用帽类似物（如抗反向帽类似物（ARCA））在IVT过程中进行共转录加帽，这是一种更便捷的方法，但ARCA产生的是cap 0 - mRNA，加帽效率低于80%，近年来一种能以94%或更高效率产生cap 1 - mRNA的改良帽类似物逐渐流行。
- 去磷酸化与纯化 ：由于加帽效率并非100%，未加帽的mRNA 5’端有三磷酸（ppp），具有免疫原性，需用碱性磷酸酶去除。IVT过程中产生的dsRNA副产物也具有免疫原性，建议使用高效液相色谱（HPLC）或纤维素进行纯化去除。

1.4 mRNA递送载体

由于mRNA在生理条件下极不稳定，组织和血液中大量存在的核糖核酸酶（RNase）会使其降解，因此通常需要递送系统将mRNA稳定、高效地递送至目标细胞。mRNA带负电荷，其负载载体的制备一般基于与带正电荷材料的静电相互作用。目前，阳离子脂质或脂质纳米颗粒（LNPs）是mRNA递送的常用载体，包括COVID - 19疫苗也采用此类载体。

LNPs由核心和外层脂质膜组成，核心包含mRNA和脂质，通常由胆固醇、辅助脂质（如1,2 - 二油酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺（DOPE））、聚乙二醇（PEG）修饰脂质和可电离脂质组成，不同研究团队开发了具有不同脂质成分的LNPs。各成分在LNPs中发挥重要作用，如PEG修饰脂质可防止LNPs聚集和与血清蛋白非特异性相互作用，可电离脂质在低pH条件（如内体）下带正电，能破坏内体膜，帮助内体中的mRNA进入细胞质。除基于脂质的载体外，基于聚合物或肽的载体也在开发中。

载体成分会影响mRNA - 载体复合物的物理化学性质（如大小和表面电荷），进而决定mRNA的递送器官。因此，为实现mRNA向目标器官或组织的高效递送，优化载体成分至关重要。此外，用能结合目标细胞表面蛋白质的配体修饰载体也是实现靶向递送的有效方法。

当因专业知识或设备不足难以制备载体时，市场上有一些基于脂质的mRNA转染试剂可供选择，如赛默飞世尔科技的Lipofectamine MessengerMAX和Takara Bio的TransIT - mRNA，主要用于体外转染。

LNPs在刺激免疫反应方面也有重要作用，mRNA疫苗虽不含佐剂，但LNP本身可充当佐剂。然而，当前mRNA疫苗易引发过度免疫反应，导致炎症疼痛和发热等副作用，因此迫切需要对免疫反应进行调控。除LNPs外，基于阳离子聚合物的载体也在研发中，如聚复合物纳米胶束，它基于mRNA与聚乙二醇（PEG） - 聚（氨基酸）嵌段共聚物的自组装形成。由于纳米胶束表面被致密的PEG栅栏覆盖，对免疫刺激影响极小，更适合用于疾病治疗。研究表明，负载治疗性mRNA的纳米胶束在关节软骨、椎间盘、脊髓和大脑等部位能产生治疗效果，且无炎症反应。

mermaid格式流程图如下：

graph LR
    A[模板DNA制备] --> B[IVT]
    B --> C[消化模板DNA]
    C --> D[酶促加帽/聚腺苷酸化]
    D --> E[去磷酸化]
    E --> F[纯化]
    F --> G[与载体结合]
    G --> H[递送至目标细胞]

二、用于生物医学应用的脱细胞组织制备

2.1 脱细胞组织简介

脱细胞组织是通过去除活组织中的细胞成分得到的细胞外基质（ECM），作为一种新型生物材料，在生物医学领域有广泛应用。目前，多种脱细胞组织（如真皮、膀胱基质和小肠黏膜下层）制成的片状和粉末状产品已在临床上用作覆盖和修复材料。与合成材料和组织提取物相比，脱细胞组织具有独特特性，因其含有生长因子、细胞外囊泡和脂质介质等生物活性物质。近年来，脱细胞组织也被称为脱细胞ECM（dECM），并提出了多种应用设想，如制备dECM水凝胶，尝试将其用作可注射水凝胶和3D打印生物墨水，还尝试通过与合成材料、生物功能分子和药物复合，为脱细胞组织添加功能。未来，脱细胞组织有望在更多生物医学领域得到应用。

2.2 脱细胞组织的应用现状与前景

脱细胞组织可作为组织再生的替代材料和支架。其主要由胶原蛋白和糖胺聚糖（GAG）等细胞外基质组成，能保留活组织复杂的三维结构。许多研究利用这一特性，将ECM作为支架植入以促进组织再生。脱细胞组织可在原位和异位诱导组织再生/新生，目前脱细胞器官的开发也在进行中。

目前，美国和欧洲市场上约有50种脱细胞组织产品，来源广泛，包括人类、猪、牛等同种异体和异种动物。这些产品大多加工成片状和粉末状，用作移植材料，如组织填充和覆盖。人们认为脱细胞组织中的各种生物活性物质可促进组织再生。

近年来，脱细胞组织的进一步应用受到关注，如将脱细胞组织溶解形成凝胶制成的脱细胞组织ECM水凝胶，可作为可注射材料、3D打印机材料和培养细胞支架。此外，通过与药物、生物活性分子和异质材料复合为脱细胞组织添加功能的尝试也在进行中。

列表如下：
- 脱细胞组织产品形式：
- 片状
- 粉末状
- 脱细胞组织应用领域：
- 组织填充
- 组织覆盖
- 可注射材料
- 3D打印生物墨水
- 培养细胞支架

2.3 脱细胞组织的制备与表征

2.3.1 制备方法

脱细胞组织的制备关键在于去除细胞成分，同时保留细胞外基质（ECM）的结构和生物活性物质。常见的制备方法有物理方法、化学方法和生物方法，以下为您详细介绍：
- 物理方法 ：通过机械力、温度变化等物理手段破坏细胞。例如，反复冻融可使细胞因冰晶形成而破裂，然后通过冲洗去除细胞碎片。超声处理也能利用超声波的空化效应破坏细胞膜，实现细胞去除。
- 化学方法 ：利用化学试剂溶解细胞膜、去除核酸等细胞成分。常用的化学试剂包括去污剂（如十二烷基硫酸钠（SDS）、 Triton X - 100）、酸（如盐酸、乙酸）和碱（如氢氧化钠）等。不同的化学试剂作用机制不同，去污剂主要通过破坏细胞膜的脂质双分子层来溶解细胞，而酸碱则可使细胞成分变性、溶解。
- 生物方法 ：使用酶类（如胰蛋白酶、DNA酶、RNA酶）消化细胞成分。胰蛋白酶可水解细胞表面的蛋白质，使细胞从组织上脱离，DNA酶和RNA酶则可分别降解细胞内的DNA和RNA。

在实际应用中，通常会结合多种方法以达到更好的脱细胞效果。例如，先采用物理方法使细胞初步破碎，再用化学试剂进一步去除细胞成分，最后用生物酶处理去除残留的核酸等物质。

2.3.2 表征指标

制备好的脱细胞组织需要进行全面的表征，以评估其质量和适用性。以下是一些主要的表征指标：
- 成分分析 ：通过生化分析方法确定脱细胞组织中ECM的主要成分，如胶原蛋白、糖胺聚糖（GAG）等的含量。常用的方法有羟脯氨酸测定法用于检测胶原蛋白含量，阿利新蓝染色法用于检测GAG含量。
- 结构观察 ：利用显微镜技术（如光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM））观察脱细胞组织的微观结构，确保其三维结构得到保留。SEM可清晰显示组织的表面形貌，TEM则能观察到组织内部的超微结构。
- 生物活性检测 ：检测脱细胞组织中生物活性物质（如生长因子、细胞外囊泡等）的含量和活性。例如，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测生长因子的含量，通过细胞实验评估脱细胞组织对细胞增殖、分化的影响。
- 免疫原性评估 ：评估脱细胞组织的免疫原性，确保其在体内不会引发过度的免疫反应。常用的方法有淋巴细胞增殖实验、细胞因子释放检测等。

表格如下：
| 表征指标 | 检测方法 | 作用 |
| ---- | ---- | ---- |
| 成分分析 | 羟脯氨酸测定法、阿利新蓝染色法 | 确定ECM主要成分含量 |
| 结构观察 | 光学显微镜、SEM、TEM | 观察微观结构 |
| 生物活性检测 | ELISA、细胞实验 | 检测生物活性物质含量和活性 |
| 免疫原性评估 | 淋巴细胞增殖实验、细胞因子释放检测 | 评估免疫原性 |

2.4 脱细胞组织的功能化

为了进一步拓展脱细胞组织的应用范围，提高其性能，研究人员尝试对脱细胞组织进行功能化。以下是一些常见的功能化方法：
- 与合成材料复合 ：将脱细胞组织与合成材料（如聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）等）结合，可改善脱细胞组织的力学性能和加工性能。例如，将脱细胞组织与PLA制成复合材料，可用于制备具有一定强度和形状的组织工程支架。
- 负载生物活性分子 ：在脱细胞组织中负载生物活性分子（如生长因子、细胞因子、药物等），可增强其促进组织再生的能力。例如，将血管内皮生长因子（VEGF）负载到脱细胞组织中，可促进血管生成，加速组织修复。
- 表面修饰 ：通过表面修饰改变脱细胞组织的表面性质，如亲水性、生物相容性等。常用的表面修饰方法有等离子体处理、接枝改性等。例如，通过等离子体处理可在脱细胞组织表面引入极性基团，提高其亲水性，有利于细胞黏附。

列表如下：
- 功能化方法：
- 与合成材料复合
- 负载生物活性分子
- 表面修饰
- 功能化效果：
- 改善力学和加工性能
- 增强组织再生能力
- 改变表面性质

2.5 脱细胞组织的应用案例

脱细胞组织在生物医学领域有广泛的应用，以下为您介绍一些具体的应用案例：
- 皮肤修复 ：脱细胞真皮基质可用于皮肤创伤修复，为皮肤细胞提供适宜的生长环境，促进皮肤组织再生。例如，在烧伤、慢性溃疡等皮肤损伤的治疗中，脱细胞真皮基质可作为覆盖材料，加速伤口愈合，减少瘢痕形成。
- 心血管修复 ：脱细胞血管基质可用于血管组织工程，构建人工血管。脱细胞血管基质保留了天然血管的结构和生物活性成分，能支持血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的生长和功能，有望用于血管移植和血管疾病的治疗。
- 软骨修复 ：脱细胞软骨基质可用于软骨组织工程，为软骨细胞提供三维支架，促进软骨再生。在骨关节炎等软骨疾病的治疗中，脱细胞软骨基质可作为软骨修复材料，改善关节功能。

mermaid格式流程图如下：

graph LR
    A[组织获取] --> B[脱细胞处理]
    B --> C[表征]
    C --> D{是否合格}
    D -- 是 --> E[功能化]
    D -- 否 --> B
    E --> F[应用]

综上所述，mRNA药物和疫苗以及脱细胞组织在生物医学领域展现出巨大的应用潜力。mRNA药物和疫苗凭借其独特的优势，为传染病防治和疾病治疗提供了新的策略；脱细胞组织作为一种新型生物材料，在组织再生和修复方面具有广阔的应用前景。随着技术的不断发展和研究的深入，相信它们将为人类健康带来更多的福祉。