氧化石墨烯增强细胞黏附的复合涂层

用于医疗器械生物功能化的复合聚电解质多层膜

摘要

聚电解质多层涂层（PEM）通过在带电表面交替逐层沉积阳离子和阴离子聚电解质单层制备而成。涂层厚度范围从纳米到几微米。其粗糙度、刚度、表面电荷和表面能等性能可精确调控，以满足不同的技术或生物需求。该涂层工艺基于聚电解质的自组装。此类涂层的优点在于操作简便、无需强化学条件，并可在复杂几何结构上进行涂覆。PEM涂层可由多种合适的聚电解质制备，其稳定性差异较大，从仅溶于强溶剂的耐用PEM涂层到可快速降解的涂层，后者可用作药物释放系统。一种可降解的PEM系统的实例是基于透明质酸（HA）和壳聚糖（CHI）这一聚电解质对的系统。这些生物聚合物来源于天然来源，对人体细胞低毒性。然而，透明质酸/壳聚糖多层膜对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的黏附性较弱。本文总结了我们通过掺入非聚合物物质——氧化石墨烯——来增强透明质酸/壳聚糖多层膜，以改善细胞黏附性，同时保持低细胞毒性和生物降解性的研究方法。我们采用了多种氧化石墨烯掺入方法，并通过代谢检测评估了细胞黏附性能。

关键词

聚电解质多层膜，生物相容性，细胞黏附，复合薄膜，氧化石墨烯

1 引言

与生物组织和体液接触的新材料开发需求正在稳步增长。近年来，构建聚电解质多层膜（PEM）已成为一种通用策略，用于在非活性生物材料与活性生物组织之间设计表面涂层，实现生物功能化和药物递送。这些多层膜的优势之一在于能够高精度地调控其结构和性能，以满足生物组织的需求。尽管已有大量聚合物被用作植入物及其涂层的合适材料，但许多材料会引发强烈的炎症和血栓形成反应。目前迫切需要对PEM涂层进行优化，并更深入地理解材料与生物系统之间的相互作用。

本文的目的是制备由透明质酸（HA）和壳聚糖（CHI）以及掺入的氧化石墨烯（GO）组成的复合聚电解质多层膜。这些复合涂层具有明确且可控的理化表面性质，并可调节与生物细胞的相互作用。选择透明质酸/壳聚糖（HA/CHI）这一聚电解质对作为植入物功能化的最有前景的材料之一，因为这些生物聚合物具有可生物降解性和无毒性。然而，这些涂层不适合促进细胞黏附 [1]。

有多种方法可以改性PEM的表面特性，从而调控其生物响应。其中一种策略是在聚电解质层的顶部或层间添加非聚合物组分。本文介绍/报道了将氧化石墨烯以不同定位方式和比例掺入透明质酸/壳聚糖薄膜中，对其性能以及对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）粘附行为的影响。氧化石墨烯是一种富含含氧官能团的超薄二维纳米材料，已被应用于生物医学领域，特别是药物递送系统。氧化石墨烯的应用前景广阔，因其表现出低毒性，并且例如与银[2]结合时具有抗癌活性。

2 实验

2.1 PEM薄膜的制备与表征

所有PEM薄膜均通过逐层自组装（LbL）技术在玻璃载片上制备。聚电解质溶解于pH 5.5的250 mM氯化钠溶液中。氧化石墨烯（GO）以浓度为0.5 mg/ml的水分散液形式使用。基底依次浸入阳离子聚合物（壳聚糖）、阴离子聚合物（透明质酸）和氧化石墨烯（GO）溶液中各10分钟。每次沉积步骤后均用新鲜的250 mM NaCl溶液冲洗（每次2分钟，共三次）。最后一次沉积完成后，样品用超纯水洗涤并在氮气中干燥。

以下为含石墨烯的聚电解质多层膜的组成 e
研究了以下氧化物：
- bPEM: PEI/(HA/CHI)10 不含氧化石墨烯的基础对照膜；
- hPEM1: PEI/(HA/CHI)9/GO 具有一层表面暴露氧化石墨烯的杂化膜；
- hPEM2: PEI/(HA/CHI)9/(GO/CHI)1 具有一层嵌入式氧化石墨烯的杂化膜；
- hPEM3: PEI/(HA/CHI)2/(GO/CHI)7/(HA/CHI)1 具有七层嵌入式氧化石墨烯的杂化膜。

PEM涂层通过椭圆偏振光谱法（德国Sentech公司）和静态接触角测量（德国Krüss公司），并采用杨‐拉普拉斯拟合方法进行表征。原子力显微镜（德国JPK公司）用于监测表面形貌以及计算表面粗糙度。峰谷粗糙度（Rz），即评估区域内五个最高峰和五个最深谷的算术平均值，被用来表征表面粗糙度。

2.2 细胞培养与细胞活力检测

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）是具有临床意义并对其周围环境高度敏感的人原代细胞。将HUVECs接种并在PEM涂层基底以及作为对照的未涂层基底上培养48小时。阳性对照为商用组织培养处理的聚苯乙烯板（Corning, USA），阴性对照为未涂层聚苯乙烯板（Greiner Bio-One, Germany）。存活的贴壁细胞的数量可通过刃天青（resazurin）显色，刃天青被细胞色素（Cytochrome）以及如NADPH/NADP、FADH/FAD还原，产生比色变化，该变化与待测细胞数量相关。

在人脐静脉内皮细胞培养48小时后，将培养基更换为含有刃天青的培养基。一种定义的孵育时间使活细胞将刃天青还原为荧光型试卤灵，后者通过荧光光谱法进行定量测定。

3 结果和结论

测量了不含和含氧化石墨烯的PEM涂层的厚度、接触角和粗糙度，结果总结于表1。所有测试的涂层厚度均相似，约为90纳米。用氧化石墨烯层替代聚合物层对厚度没有影响。粗糙度Rz相对较低（~15纳米），但含有七层氧化石墨烯的杂化PEM（hPEM3）除外，其Rz约为100纳米。

PEM	厚度，nm	接触角，度	粗糙度 Rz，纳米
bPEM	94.0 ± 2.3	57.9 ± 1.9	13.7 ± 4.0
hPEM1	84.4 ± 3.0	40.7 ± 2.1	17.7 ± 1.4
hPEM2	88.4 ± 3.0	49.6 ± 2.9	15.5 ± 0.9
hPEM3	90.0 ± 2.5	37.2 ± 2.3	100.2 ± 15.2

表面润湿性被认为是每种涂层的基本特性，因为它决定了蛋白质和其他接触分子的吸附，以及细胞和微生物的粘附[3]。基础PEM薄膜是亲水的，接触角为~58°。所有杂化薄膜更具亲水性。由于氧化石墨烯因含有含氧官能团而具有亲水性，因此杂化PEM的接触角与文献中报道的氧化石墨烯的接触角相关（根据[4], 36为46.5°，根据[5]为58.4°）。

将氧化石墨烯层引入聚电解质多层膜中会改变其表面形貌，从而影响表面粗糙度。当氧化石墨烯作为顶层沉积时，杂化hPEM1薄膜的表面粗糙度与不含氧化石墨烯的对照膜（bPEM）相似。这一事实支持了氧化石墨烯片层遵循底层形貌的假设，这基于原子力显微镜成像（图1）的结果。仅在聚合物基质中引入一层氧化石墨烯层不会影响表面粗糙度。然而，随着引入的氧化石墨烯层数增加，表面形貌发生变化，Rz（表面粗糙度参数）也随之增大，对于hPEM3而言，其值比基础对照PEM薄膜（bPEM）高出11倍，显示出存在较高的峰和较深的谷。

图2表明，人脐静脉内皮细胞在不含氧化石墨烯的对照膜（bPEM）上的粘附性非常低，与阴性对照（未处理的聚苯乙烯）相似。已有研究表明，与裸露镍钛表面相比，使用透明质酸/壳聚糖薄膜对镍钛表面进行生物功能化可使血小板粘附减少38% [6]。大多数含有超过六层双层膜的多糖多层膜表现出较差甚至抗粘附性能，这可能是由于其高水合性和低弹性模量所致。

相反，在表面暴露有氧化石墨烯层的hPEM1薄膜上，人脐静脉内皮细胞的粘附性更高，且与阳性对照相当。在氧化石墨烯层上仅沉积一层额外的壳聚糖层（hPEM2）可使粘附细胞数量减少约10%。含有七层氧化石墨烯层且顶部为一层透明质酸/壳聚糖双层的薄膜hPEM3可使人脐静脉内皮细胞粘附减少56%。

总之，hPEM1和hPEM2涂层确实改善了抗粘附性未涂层聚苯乙烯的亲细胞性。不含GO的基础对照涂层（bPEM）显示出极差的细胞黏附性，与阴性对照相当。已知细胞黏附是依赖于多种因素（如表面电荷、刚度、亲水性和粗糙度[7]）的复杂现象。我们的结果表明，HUVEC的黏附不依赖于聚电解质多层膜的厚度和亲水性，因为所有薄膜均为亲水性且厚度相似。尽管hPEM3的粗糙度远高于bPEM和hPEM1薄膜，后两者具有相似的粗糙度。这三种杂化薄膜表现出截然不同的细胞黏附行为。

结果显示，人脐静脉内皮细胞在杂化透明质酸/壳聚糖/氧化石墨烯薄膜上的粘附源于两个因素的共同作用——氧化石墨烯层数及其在聚合物基质中的位置。将氧化石墨烯层引入更靠近薄膜表面的位置可增强其细胞粘附能力。这一因素导致杂化薄膜的促粘附性能按以下顺序排列：bPEM ≤ 阴性对照 < hPEM3 < hPEM2 < hPEM1 ≤ 阳性对照。已知氧化石墨烯层具有很高的刚度（杨氏模量 ~200 GPa [8]），而高度水合的透明质酸/壳聚糖多层膜则较为柔软（杨氏模量 ~150 kPa [9]），因此杂化透明质酸/壳聚糖/氧化石墨烯薄膜的刚度应随着嵌入的氧化石墨烯层数增加以及其更靠近表面的位置而提高，这与此前报道的聚苯乙烯磺酸/聚丙烯胺/氧化石墨烯薄膜 [10]的情况类似。

因此，人脐静脉内皮细胞粘附的差异源于引入氧化石墨烯层后薄膜刚度的变化，其中表面暴露有氧化石墨烯层的hPEM1多层膜最有利于粘附。需要进一步研究以阐明氧化石墨烯在抗粘附聚电解质多层系统中促进粘附特性的具体原因，例如对深度方向上的刚度进行筛选。

4 摘要

由透明质酸（HA）和壳聚糖（CHI）形成的聚电解质多层膜具有生物相容性、非细胞毒性和可生物降解性，因此在医疗器械涂层应用方面具有良好前景，并可选择性地实现药物释放。然而，人源细胞（如原代内皮细胞）在HA/CHI涂层上的粘附较差，这将阻碍植入物的正常组织长入，并限制此类涂层在植入物上的应用。

本研究中，我们发现将氧化石墨烯以不同位置和比例掺入HA/CHI聚电解质多层涂层中，可实现原代人内皮细胞（HUVECs）在这些表面粘附的可控性。将氧化石墨烯引入透明质酸/壳聚糖多层膜中不会影响涂层的厚度和疏水性，但会影响表面硬度和粗糙度。杂化聚电解质多层涂层上细胞黏附的改善最可能是由表面硬度的变化引起的。需要进一步研究以深入分析复合薄膜性能对细胞行为的影响。