21、凯氏蛋白相互作用与生物钟振荡机制解析

凯氏蛋白相互作用与生物钟振荡机制解析

1. 凯氏蛋白磷酸化状态模拟与结合特性

丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的非磷酸化状态可由丙氨酸（A）模拟，而它们的磷酸化状态分别由天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）模拟。由此，凯氏蛋白C（KaiC）在替代S431和T432位点时，存在四种磷酸化模拟状态：KaiC - AA、KaiC - AE、KaiC - DE和KaiC - DA。

通过高速原子力显微镜（HS - AFM）对这四种KaiC磷酸化模拟物进行观察，发现结合到KaiC上的KaiA分子数量明显依赖于KaiC的磷酸化模拟状态。与磷酸化依赖性差异亲和力（PDDA）假说一致，低磷酸化KaiC模拟物与KaiA的结合时间显著长于高磷酸化KaiC模拟物。例如，KaiC - DE的结合时间（τbound）为0.26 ± 0.05 s，KaiC - DA为0.43 ± 0.14 s，KaiC - AE为1.00 ± 0.15 s，而KaiC - AA由于结合时间过长难以准确测定。此外，KaiC - pS/T和KaiC - S/pT这两种单位点磷酸化状态与KaiA的亲和力不同，KaiC - S/pT与KaiA的结合时间是KaiC - pS/T的两倍多，这表明T432位点的磷酸化对与KaiA的亲和力变化影响更大。

KaiA与低磷酸化和高磷酸化KaiCWT以及相应磷酸化模拟物的相互作用表明，KaiA - KaiC结合的起始依赖于KaiC六聚体的磷酸化状态（τunbound），而一旦结合，KaiC磷酸化程度的增加会使结合变得不稳定（τbound）。由于KaiA与KaiC C端触手的结合会刺激KaiC的自激酶活性，因此这些不同的KaiA - KaiC亲和力（PDDA）会影响KaiC的磷酸化速率，具体取决于KaiC的磷酸