SCF诱导肥大细胞功能独立于CD81

第三章

干细胞因子诱导肥大细胞脱颗粒和增殖，且独立于CD81受体

3.1 引言

干细胞因子（SCF）受体又称Kit，属于受体酪氨酸激酶的III型亚类。Kit的信号传导机制已在包括干细胞在内的多种细胞类型中得到广泛研究。Kit或SCF信号的缺失会导致造血系统、神经系统和生殖系统的发育异常（[1–5]）。研究表明，Kit可与I型细胞因子受体相互作用以执行特定功能，例如促红细胞生成素受体（EpoR）[6,7]、白介素‐7受体（IL‐7R）[8]、和白介素‐3受体（IL‐3R）[9]。此外，Kit也被证实可与CD81受体相互作用，CD81属于四跨膜蛋白（TM4SF）家族[10]。但迄今为止，关于Kit与CD81的关联的生物学意义尚无报道。

Kit[11]和CD81信号通路均被证明可调控肥大细胞脱颗粒[12]。在本研究中，我们试图理解Kit与CD81的关联的生物学意义。通过肥大细胞脱颗粒实验和胸苷掺入法，我们报道了干细胞因子（SCF）诱导的肥大细胞功能独立于CD81受体。

3.2 方法

3.2.1 细胞培养和干细胞因子（SCF）刺激

所有涉及动物的实验程序均按照斯坦福大学实验动物护理与使用委员会（机构动物护理和使用委员会，IACUC）批准的方案进行。Balb/cj野生型 [wt] 和 CD81阴性小鼠购自缅因州巴港的杰克逊实验室。

骨髓（BM）来源的肥大细胞（BMMC）培养物的建立方法如前所述[13]。从4至8周龄小鼠的股骨和胫骨中获取的骨髓细胞（野生型 [wt]和CD81 2/2小鼠）用于生成肥大细胞培养物。培养物使用小鼠IL‐3（英潍捷基（Invitrogen））和干细胞因子（SCF）（英潍捷基（Invitrogen））进行维持，[20ng/mL 每种，持续 4–6 周。对于干细胞因子（SCF）刺激，肥大细胞在无生长因子条件下培养 12 小时，然后在不含或含 2% FCS 的肥大细胞培养基中继续孵育 4 小时。细胞刺激按照所示使用 20 ng/mL SCF 进行。

3.3 流式细胞术

为了分析肥大细胞表面Kit、Fcε受体I（FcεRI）和CD81的表达，将去除生长因子的肥大细胞用别藻蓝蛋白偶联的大鼠抗Kit抗体（克隆2B8；BD生物科学）和小鼠抗二硝基苯基免疫球蛋白（Ig）E（克隆SPE‐7；西格玛奥德里奇）进行标记，随后分别使用荧光素异硫氰酸盐 偶联的大鼠抗 小鼠IgE抗体（克隆R35‐72；BD生物科学）和藻红蛋白偶联的抗CD81（克隆Eat2；BD生物科学）进行标记。所有标记步骤均包含使用小鼠BD Fc阻断剂（BD生物科学）阻断小鼠FcγRIII/II的步骤，并通过同种型匹配的非特异性抗体染色作为对照。抗体标记细胞使用 FACSVantage流式细胞仪（BD生物科学）通过流式细胞术进行分析。

3.4 类胰蛋白酶脱颗粒实验

干细胞因子（SCF）诱导的肥大细胞类胰蛋白酶脱颗粒通过肥大细胞脱颗粒实验试剂盒（Millipore, Billeric, MA）进行分析。实验严格按照供应商建议的方案进行。

3.5 胸苷掺入

在测量细胞增殖之前，肥大细胞在不含干细胞因子（SCF）和白细胞介素‐3（IL‐3）的条件下培养12小时。将细胞以每孔10万个细胞的浓度接种于96孔组织培养板中，每孔体积为 100 μL。经过12小时孵育后，加入 1 μCi 3H‐胸苷脉冲标记6小时，随后使用液体闪烁计数器（珀金埃尔默）测定胸苷掺入量。

3.6 结果

3.6.1 野生型和CD81阴性肥大细胞在表面水平表达相同的Kit受体

SCF受体Kit已被证明与CD81受体相关联[10]。但Kit与CD81受体的关联在生物学上的意义尚不明确。为了理解CD81在干细胞因子（SCF）诱导的Kit功能中的作用，本研究使用了骨髓来源的肥大细胞。已知肥大细胞表达Kit和FCεRI受体[13]。

本研究显示，野生型和CD81阴性肥大细胞以相同的表面水平表达Kit和FCεRI受体（图3.1B和C）。对野生型和CD81阴性肥大细胞中CD81受体的表面表达水平进行了分析，结果如（图3.1D）所示。

3.7 干细胞因子（SCF）诱导肥大细胞脱颗粒与CD81无关

肥大细胞脱颗粒已被报道为研究SCF诱导Kit功能的检测指标之一。在本研究中，我们检测了CD81是否在SCF诱导的肥大细胞脱颗粒过程中发挥作用。正如先前报道的，在野生型细胞中，我们观察到SCF以时间依赖性方式诱导肥大细胞脱颗粒。我们在CD81阴性肥大细胞中也观察到了类似的效果，表明CD81受体对SCF诱导的肥大细胞脱颗粒没有影响（图3.2）。

3.8 干细胞因子（SCF）诱导肥大细胞增殖与CD81无关

先前的研究表明，干细胞因子（SCF）可诱导肥大细胞增殖。干细胞因子（SCC）与白细胞介素‐3（IL‐3）共同刺激可导致肥大细胞增殖的协同作用。在本研究中，我们检测了CD81受体是否对干细胞因子（SCF）诱导的肥大细胞增殖有影响。干细胞因子（SCF）诱导在野生型和CD81阴性肥大细胞中均引起肥大细胞增殖。用干细胞因子（SCF）和白细胞介素‐3（IL‐3）共同刺激细胞可导致肥大细胞增殖的协同作用。在野生型和CD81阴性肥大细胞之间，未观察到增殖或增殖协同作用的可比差异（图3.3）。

3.9 讨论

在本研究中，我们报道了Kit信号通路介导的肥大细胞脱颗粒和增殖与CD81信号通路无关。我们还观察到Kit介导的Ca²⁺流与CD81无关（数据未显示）。这一发现进一步排除了CD81在Kit介导的膜和离子通道功能中的作用可能性。事实上，在本研究的所有实验中，Kit与CD81的关联背后的生物学功能仍然是未解之谜。

Kit信号传导已被证明参与肌动蛋白重组[13]。CD81作为四次跨膜蛋白受体家族成员，可能对Kit介导的肌动蛋白重组是必需的，这仍有待验证。更好地理解Kit和CD81信号通路及其相关性，可能为针对过敏和肥大细胞增多症的药物靶向提供良好的参考依据。