28、卒中研究与精准医学方法解析

卒中研究与精准医学方法解析

1. SITS数据库访问权限

SITS数据库在卒中研究中具有重要价值，那么谁可以访问该数据库呢？
- 活跃的SITS用户若想基于SITS注册数据开展科研项目，可向SITS科学委员会（SC）提交科研项目提案。
- SITS科学委员会会对提案进行评审，判断项目质量是否达标、是否适合使用SITS国际数据。
- 若提案获得批准，研究人员将获得开展项目所需的数据。
- 而国家数据方面，国家协调员和国内的任何中心都可使用，无需SITS科学委员会批准。

以下是获取SITS国际数据的流程：

graph LR
    A[活跃SITS用户] --> B[提交科研项目提案]
    B --> C[SITS科学委员会评审]
    C -->|批准| D[提供必要数据]
    C -->|未批准| E[项目不通过]

2. 基于注册研究的新挑战

2.1 数据互操作性挑战

为了持续或增加患者入组数量，注册系统需要适应新型医疗信息技术语义，以提高电子健康记录（EHR）与注册数据库结构之间的互操作性。如今，许多注册系统直接从EHR中提取数据，减少了手动输入和录入错误。例如，使用开源EHR语言（openEHR）应用于指南，即所谓的指南定义语言（GDL）。在SITS注册系统的实验中，应用openEHR GDL技术可用于检查指南依从性，但由于SITS注册系统并非基于openEHR运行，仍需一些手动步骤。由此可见，互操作性已成为大型临床注册系统发展和可持续性的关键问题，对数据库的规划、设计和分析都有影响。

2.2 以患者为中心的结果研究挑战

近十年来，以患者为中心的结果研究（PCOR）逐渐兴起。该研究关注对患者及其家属有价值、有意义且更偏好的结果，能指导医生和患者做出更好的决策。这一概念对患者注册系统的创建产生了影响，患者可直接报告结果指标，或在现有注册系统中增加患者报告结果的部分，从而重塑注册系统设计。注册系统还可考虑在顾问委员会中增加患者代表。然而，仍存在一些未解决的伦理和监管问题，比如患者在新责任角色中应受到何种程度的保护，如何确保患者熟悉数据输入新技术以及保障数据隐私等。SITS协调团队正在脑静脉血栓形成协议中开发PCOR问题子部分，目前由医生询问患者，未来患者或其亲属可通过手机应用直接输入。

以下是基于注册研究面临的挑战总结表格：
|挑战类型|具体内容|影响|
| ---- | ---- | ---- |
|数据互操作性|适应新型医疗信息技术语义，提高EHR与注册数据库结构的互操作性|影响大型临床注册系统的发展和可持续性|
|以患者为中心的结果研究|关注患者偏好结果，重塑注册系统设计，存在伦理和监管问题|影响注册系统设计和患者参与度|

3. 注册研究的局限性与注意事项

与随机对照试验（RCT）不同，基于注册的观察性研究无法确定因果关系，只能提供关联证据支持潜在的因果关系。在利用注册数据进行研究时，研究设计至关重要。偏差是影响注册研究有效性的最重要因素，不同的科学问题和注册系统，偏差情况也不同。研究结果的解释应结合研究人群的背景。在进行任何分析之前，制定清理大型数据集的数据管理协议和预先指定的统计分析计划是必不可少的。

4. 精准医学简介

生物医学研究中数据量的不断增加催生了一种新的医学方法——精准医学。精准医学旨在在诊断、治疗和管理患者预后时考虑个体特征，将健康干预（预防或治疗）集中在能从中受益的人群上，从而避免不必要的副作用，更有效地分配医疗资源。

生物标志物是推动精准医学发展的关键因素。它是客观测量和评估的特征，可作为正常生物过程、致病过程或药物治疗反应的指标。生物标志物具有多种功能，如检测特定疾病的高易感性或风险、诊断疾病、纵向监测疾病以及预测预后。在药物开发中，生物标志物也起着重要作用，可预测治疗反应、评估药效学和安全性、监测临床反应。

精准医学可利用多种体内生物样本，从宏观的器官分析到微观/纳米级的组织、细胞和分子分析。

5. 器官、组织和细胞研究方法

5.1 解剖病理学研究

除了尸检和手术切除标本的大体检查可宏观评估器官外，解剖病理学研究主要侧重于组织学实践，即研究组织及其两个相互作用的成分：细胞和细胞外基质。组织学研究大多在体外进行，需经过复杂过程以保存体内观察到的细胞结构，防止样本变质。之后，将组织切成薄而透明的切片，以便进行显微镜观察。

5.2 显微镜技术

显微镜技术大致分为光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM）。光学显微镜利用光与组织成分相互作用，包括明场显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、共聚焦显微镜和偏光显微镜等多种类型，其类型主要取决于光源的波长范围和发散度、滤光片、聚光镜和透镜系统等因素。电子显微镜则利用电子束，电子束的波长比光短得多，可将分辨率提高1000倍，但图像为黑白灰度。电子显微镜主要有透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）两种类型，TEM可提供样本的截面视图，SEM可在样本表面涂上金属离子后提供样本表面的三维图像。

以下是显微镜技术的分类表格：
|显微镜类型|作用原理|特点|
| ---- | ---- | ---- |
|光学显微镜（LM）|光与组织成分相互作用|多种类型，取决于光源、滤光片等因素|
|电子显微镜（EM）|电子束与组织成分相互作用|分辨率高，图像为黑白灰度|

5.3 使细胞可见的技术

由于组织和细胞大多无色（除天然色素外），需要使用多种技术来区分不同细胞类型和微观成分：
- 染色 ：根据染料与大分子的静电结合，选择性地染色不同成分。例如，常用的苏木精 - 伊红（H&E）染色，苏木精是碱性染料，可结合嗜碱性成分如DNA、RNA和糖胺聚糖；伊红是酸性染料，可与嗜酸性成分如线粒体、分泌颗粒和胶原蛋白相互作用。
- 放射自显影 ：向活细胞提供放射性标记的代谢物，使其掺入目标大分子中。样本处理和切片后，通过溴化银晶体检测放射性，并对显微镜载玻片进行摄影显影。
- 酶组织化学或细胞化学 ：将未经太多处理的组织切片暴露于特定底物后，再加入目标酶。然后添加检测酶反应的标记化合物，通过光学显微镜或电子显微镜检测其沉淀，从而确定细胞内的反应位点。
- 免疫组织化学 ：使用抗体特异性靶向抗原（主要是高分子量蛋白质），可通过直接标记抗体（直接免疫组织化学）或间接标记二级抗体（间接免疫组织化学）来标记抗原。这些标记抗体可与不同标记物结合，用于不同类型的显微镜观察。
- 原位杂交（ISH） ：使用单链DNA或RNA标记探针结合特定互补链（如基因、病毒等）。探针可标记放射性核苷酸（使用放射自显影）、化合物（如地高辛，使用免疫细胞化学）或荧光染料（使用荧光显微镜）。使用荧光探针的ISH称为荧光原位杂交（FISH）。

5.4 细胞生物学新技术

抗体和荧光技术的应用不仅革新了组织学研究，也为细胞生物学带来了新的发展。例如，流式细胞术和质谱流式细胞术可通过间接检测特定细胞标记物来分析细胞。流式细胞术常用于免疫学和血液学，通过激光激发荧光抗体或染料来识别细胞或细胞内成分。细胞在层流中流动，不同抗体或染料有不同的发射光谱，通过不同滤光片检测，可同时评估多种细胞成分。质谱流式细胞术则使用标记有稀有重金属同位素的抗体，细胞在单细胞悬浮液中雾化后释放重金属报告离子，通过飞行时间（TOF）检测每个离子的质量，从而解码每个细胞的精确成分。由于流式细胞术的发射光谱有显著重叠，质谱流式细胞术能同时分析更多参数。

目前，相关技术也在不断拓展。以荧光显微镜为例，已发展出荧光纳米显微镜（分辨率低于50nm）、多光子显微镜（可实现人体无创体内细胞成像）和成像流式细胞术（为流式细胞术提供荧光细胞成像）等新技术。

以下是使细胞可见技术的总结列表：
- 染色
- 放射自显影
- 酶组织化学或细胞化学
- 免疫组织化学
- 原位杂交（ISH）

6. 流式细胞术和质谱流式细胞术对比

流式细胞术和质谱流式细胞术虽然都是用于细胞分析的重要技术，但它们在原理、特点和应用上存在明显差异。

技术类型	原理	特点	应用场景
流式细胞术	利用激光激发荧光抗体或染料，根据不同的发射光谱检测细胞或细胞内成分	操作相对简单，成本较低，但发射光谱有显著重叠，可分析的参数有限	常用于免疫学和血液学等领域的常规细胞分析
质谱流式细胞术	使用标记有稀有重金属同位素的抗体，通过检测重金属报告离子的飞行时间来确定细胞成分	分辨率高，可同时分析更多参数，但设备和试剂成本较高	适用于对细胞成分进行更精细、全面分析的研究

6.1 流式细胞术操作流程

1. 样本制备 ：将细胞制成单细胞悬浮液，确保细胞的活性和分散性。
2. 抗体标记 ：选择合适的荧光抗体与细胞进行孵育，使抗体与目标细胞标记物结合。
3. 上样检测 ：将标记好的细胞样本注入流式细胞仪，细胞在层流中依次通过激光束，激发荧光信号。
4. 数据分析 ：使用专门的软件收集和分析荧光信号，根据不同的发射光谱区分不同的细胞成分。

6.2 质谱流式细胞术操作流程

1. 样本制备 ：同样将细胞制成单细胞悬浮液。
2. 抗体标记 ：使用标记有稀有重金属同位素的抗体与细胞孵育。
3. 雾化处理 ：将标记好的细胞样本进行雾化，使细胞释放出重金属报告离子。
4. 检测分析 ：离子通过飞行时间质谱仪，根据离子的质量确定细胞的精确成分。

以下是流式细胞术和质谱流式细胞术操作流程的mermaid流程图：

graph LR
    classDef startend fill:#F5EBFF,stroke:#BE8FED,stroke-width:2px
    classDef process fill:#E5F6FF,stroke:#73A6FF,stroke-width:2px

    A([样本制备]):::startend --> B(抗体标记):::process
    B --> C{技术类型}:::process
    C -->|流式细胞术| D(上样检测):::process
    C -->|质谱流式细胞术| E(雾化处理):::process
    D --> F(数据分析):::process
    E --> G(检测分析):::process
    F --> H([结束]):::startend
    G --> H

7. 荧光显微镜新技术拓展

荧光显微镜在细胞成像领域有着广泛的应用，近年来其新技术的拓展进一步提升了其性能和应用范围。

7.1 荧光纳米显微镜

荧光纳米显微镜突破了传统光学显微镜的分辨率极限，能够实现低于50nm的分辨率。其原理是利用特殊的荧光标记和成像技术，对细胞内的纳米级结构进行高分辨率成像。例如，通过单分子定位显微镜技术，可精确确定荧光分子的位置，从而重建出细胞内的精细结构。

7.2 多光子显微镜

多光子显微镜允许在人体进行无创的体内细胞成像。它利用多光子激发原理，使荧光分子在长波长激光的激发下发出荧光。由于长波长激光对组织的穿透能力强，且多光子激发只发生在焦点附近，因此可以实现对深部组织的高分辨率成像，减少对周围组织的损伤。

7.3 成像流式细胞术

成像流式细胞术将流式细胞术和荧光显微镜技术相结合，为流式细胞术提供了荧光细胞成像功能。它不仅可以像流式细胞术一样快速分析大量细胞，还能同时获取细胞的图像信息，从而更直观地观察细胞的形态和结构。

以下是荧光显微镜新技术的特点和应用总结表格：
|技术名称|特点|应用|
| ---- | ---- | ---- |
|荧光纳米显微镜|高分辨率，可观察纳米级结构|研究细胞内的精细结构和分子相互作用|
|多光子显微镜|无创体内成像，深部组织高分辨率成像|活体组织研究和疾病诊断|
|成像流式细胞术|结合流式细胞术和荧光显微镜，提供细胞图像信息|细胞形态和结构分析，以及细胞亚群的鉴定|

8. 总结

从卒中研究中的注册数据应用到精准医学的多层面研究方法，我们看到了生物医学研究领域的不断发展和创新。基于注册的研究虽然存在一定局限性，但在提供关联证据、指导临床实践方面仍具有重要价值。而精准医学通过考虑个体特征，利用生物标志物和多种研究技术，为疾病的诊断、治疗和预后管理带来了新的思路和方法。

在组织和细胞研究方面，从传统的组织学方法到现代的细胞生物学新技术，为我们深入了解生物体内的微观世界提供了有力工具。不同的研究技术各有优缺点，适用于不同的研究场景和问题。未来，随着技术的不断进步和创新，我们有望在生物医学领域取得更多的突破，为人类健康事业做出更大的贡献。