热邻近共聚集技术升级 | Slim-TPCA 实操指南：一篇教你如何用三个温度点筛选互作蛋白

前言

宝子们做互作蛋白筛选时，是不是被传统 TPCA 的 “10 个温度点魔咒” 劝退过？样品要得多、批次效应难控制、数据分析耗时长，想快速拿到可靠结果简直难上加难！

好在 2023 年 Nat Commun 重磅推出 Slim-TPCA 技术突破，直接把温度点精简到 3-4 个，通量提升 3 倍、计算时间缩短 100 倍，还能保留蛋白天然互作状态，不用抗体和标签也能精准筛选。今天这篇实操指南，就把这份 “简化版神技” 拆解得明明白白，新手也能直接落地！

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一、技术突破核心：为什么 3 个温度点就能打赢传统 10 个？

传统 TPCA 的痛点的是 “冗余且低效”—— 10 个梯度温度（37-64℃）看似全面，却导致样品消耗大、批次误差突出，还得靠海量计算支撑结果。而 Slim-TPCA 的核心是 “精准精简”，而非简单删减，每一处改进都直击要害：

▶ 温度点优化：通过 6 种距离度量方法验证，锁定 3 个黄金温度点（37℃、49℃、58℃）或 4 个扩展温度点（37℃、46℃、55℃、61℃），与 10 个温度点的筛选结果相关性高达 0.9 以上，信息损失几乎可忽略。

▶ 算法升级：用曼哈顿距离替代欧氏距离（对少量数据点的噪音容忍度更高），新增相对距离算法 + Beta 分布拟合算法（替代传统 Bootstrap 抽样），既能捕获瞬时互作和强特征复合物，还把统计计算时间从几天压缩到小时级。

▶ 样品量锐减：结合 SISPROT 技术，每温度点蛋白用量最低可至 1μg，珍贵临床样品、少量原代细胞也能用上，实验成本直接砍半。

简单说，Slim-TPCA 既保留了 “原位捕获天然互作” 的核心优势，又解决了传统方法 “麻烦、费样、耗时间” 的三大痛点，普通实验室也能轻松开展高通量筛选。

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二、实验前期准备：材料仪器清单（直接照买 / 凑齐）

（一）核心试剂（优先选 LC-MS 级和测序级）

▶ 样品：细胞（对数期，≥1×106即可，比传统省 10 倍）、新鲜组织（50mg 以内）或临床样本

▶ 裂解液（非变性，关键配方）：100mM HEPES pH7.5、20mM MgCl₂、10mM β- 甘油磷酸钠、2mM TCEP、0.2mM 钒酸钠、0.2% DDM、EDTA-free 蛋白酶抑制剂，现配现用（严禁加 SDS！会破坏蛋白互作）

▶ 辅助试剂：TMT/TMTpro 标记试剂（16 标最优，消除批次效应）、测序级胰蛋白酶（可选 Lys-C 辅助酶解）、C18 脱盐柱、考马斯亮蓝染色液、5× 蛋白上样缓冲液

▶ 缓冲液：预冷 PBS（pH7.4）、0.1% 甲酸溶液、50% 乙腈 / 0.1% 甲酸溶液（肽段提取用）、25mM NH₄HCO₃（酶解用）

（二）必备仪器（实验室常规配置即可）

▶ 基础设备：高速冷冻离心机（≥21000g，4℃）、梯度 PCR 仪（精准控温 ±0.5℃）、超声破碎仪、NanoDrop（蛋白定量）、真空冷冻干燥机

▶ 检测设备：SDS-PAGE 电泳系统、Western Blot 仪、高分辨质谱仪（Orbitrap Exploris 480 或 Q Exactive 系列）

▶ 辅助工具：耐高温 PCR 管、移液器（10μL-1mL）、-80℃冰箱、液氮罐（冻融裂解用）

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三、分步实操流程：3 个温度点搞定筛选（附关键细节）

（一）样品制备：温柔裂解，留住天然互作

1. 细胞样品：收集 1×10⁶对数期细胞，预冷 PBS 洗 2 次（4℃ 800g 离心 5min），弃上清后加 500μL 预冷裂解液

2. 组织 / 临床样品：取 20-50mg 样品，剪碎为 1mm³ 小块，加 3 倍体积裂解液，冰浴超声（功率 20%，工作 3s 停 5s，共 20 次）

3. 裂解与澄清：冰浴轻柔振荡 30min，再经液氮速冻 - 37℃水浴速融循环 3-5 次（辅助裂解，不破坏复合物）；4℃ 12000g 离心 15min，取上清用 BCA 法定量，调整浓度至 0.5-1mg/mL，冰浴备用

【敲黑板】裂解全程冰浴，避免剧烈涡旋，去垢剂浓度不超过 2%，否则会拆散蛋白互作！

（二）热诱导聚集：核心简化步骤，3 个温度点就够

1. 分装样品：每管 20μL 蛋白样品（含 10-20μg 蛋白），设置 3 组重复；同时设阴性对照（20μL 裂解液）、空白对照（20μL PBS）

2. 梯度升温：PCR 仪按 “37℃×10min→49℃×10min→58℃×10min” 运行，每个温度结束后立即冰浴 10min 终止反应（非人类物种需先做 10 点预实验，找蛋白组平均熔解温度 Tm，再选 Tm 附近均匀分布的 3 个点）

3. 聚集体分离：4℃ 21000g 离心 20min，小心吸走上清（游离蛋白），沉淀用 20μL 预冷 PBS 轻柔吹打重悬（避免涡旋）

【小技巧】PCR 管全程同一面朝向离心机转子，后续取样更精准，减少误差！

（三）蛋白检测与质谱样品制备

1. SDS-PAGE 验证：取沉淀重悬液 10μL+2μL 5× 上样缓冲液，95℃煮沸 5min；12% 胶电泳（80V 积层胶 30min，120V 分离胶 90min），考马斯亮蓝染色观察条带差异

2. 胶内酶解：切取目标条带（1mm³ 小块），乙腈脱水→10mM DTT 56℃还原 30min→55mM 碘乙酰胺避光烷基化 30min→测序级胰蛋白酶 37℃酶解过夜（酶：蛋白 = 1:50）

3. 肽段提取与纯化：50% 乙腈 / 0.1% 甲酸溶液提取 2 次，合并上清真空冻干；C18 脱盐柱预处理（甲醇活化→0.1% 甲酸平衡），上样后洗涤 3 次，用提取液洗脱并再次冻干

（四）LC-MS/MS 分析与数据分析（灵魂步骤）

1. 质谱检测：肽段用 0.1% 甲酸复溶，TMT 标记后上样；参数设置：EASY-Spray C18 柱（20cm×100μm），流动相 A 相（0.5% 乙酸水溶液）、B 相（80% 乙腈 + 0.5% 乙酸），梯度洗脱 90-120min，离子源电压 2.0kV，MS1 分辨率 60000，MS2 分辨率 30000

2. 数据预处理：

▶ 安装工具：Python 环境中用pip install Slim-TPCA安装专用包（https://slim-tpca.readthedocs.io/）

▶ 归一化：高温点（49℃、58℃）蛋白丰度 ÷37℃丰度，得到 “可溶性分数”

▶ 过滤：剔除 37℃未检出、高温下溶解度异常升高的蛋白（避免假阳性）

3. 核心分析：

▶ 距离计算：用曼哈顿距离评估蛋白间溶解度相似度

▶ 统计检验：Beta 分布拟合计算 p 值（仅需 500 次采样，比传统 10000 次快 100 倍）

▶ 动态判定：Convergent（趋同，复合物组装增强）、Divergent（趋异，复合物解离）

▶ 筛选标准：Fold Change＞2、p＜0.05，剔除阴性对照中检出的蛋白

4. 功能注释：STRING 数据库构建互作网络（置信度＞0.7），GO/KEGG 富集分析（p＜0.05）

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四、典型应用案例：3 个温度点发高分文章的核心思路

以 2023 年 Nat Commun 的标杆研究为例，看看如何用简化方案解决关键科学问题：

案例：葡萄糖剥夺下 K562 细胞的代谢重编程机制解析

1. 实验设计：3 个黄金温度点（37℃、49℃、58℃），分析 K562 细胞在葡萄糖剥夺 0h、4h、8h、24h、48h 的蛋白复合物动态，3 次生物学重复 + TMT16 标质谱同步检测。

2. 核心发现：

▶ 解离复合物：55S 核糖体（胞质及线粒体）、线粒体呼吸链复合物 V（F1F0 ATP 酶）在剥夺后 4-24h 显著解离，对应蛋白翻译和有氧呼吸暂时下调，减少能量消耗。

▶ 组装复合物：囊泡运输复合物（BLOC、BORC）、蛋白降解复合物（20S 蛋白酶体、E3 连接酶复合物）持续组装，提示细胞通过 “物质回收 + 氨基酸再利用” 适应营养缺乏。

▶ 关键验证：Co-IP 证实 Emerin 复合物 1 和 USP22-SAGA 复合物的动态组装，与 Slim-TPCA 结果完全一致。

【文章亮点】仅用 3 个温度点，就清晰勾勒出癌细胞代谢适应的蛋白复合物调控网络，实验周期缩短 50%，还成功捕获了线粒体膜结合复合物的动态变化 —— 这是传统方法难以高效实现的。

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五、避坑指南：新手必看的 5 个关键问题

Q1：聚集效率低，条带不明显？

▶ 原因：温度点不匹配、蛋白浓度太低、裂解液离子强度不适

▶ 解决方案：换 4 个温度点组合（37℃、46℃、55℃、61℃）；蛋白浓度提高到 1mg/mL；调整 NaCl 浓度至 100-200mM，加 0.5% 甘油增强稳定性

Q2：非特异蛋白多，假阳性高？

▶ 原因：洗涤不充分、孵育温度过高、裂解液用了 SDS

▶ 解决方案：沉淀用预冷 PBS 洗涤 1 次（4℃ 21000g 离心 5min）；核心温度点下移 5℃；严禁用 SDS，去垢剂优先选 0.2% DDM 或 1% NP-40

Q3：非模式生物（植物 / 细菌）能用吗？

▶ 关键：37℃、49℃、58℃仅适用于人类细胞

▶ 解决方案：先做 10 个温度点的预实验，找出该物种蛋白组的平均熔解温度 Tm，再选 Tm 附近及两侧均匀分布的 3 个点

Q4：质谱鉴定蛋白数量少？

▶ 原因：酶解不完全、肽段提取效率低

▶ 解决方案：胰蛋白酶用量加倍（酶：蛋白 = 1:25）；提取时超声辅助 10min；延长梯度洗脱时间至 120min

Q5：筛选结果如何验证？

Slim-TPCA 是高通量筛选，结果需进一步验证：

▶ 体外验证：Co-IP/Western Blot 验证候选蛋白与诱饵蛋白的结合变化

▶ 功能验证：如检测 ATP 水平佐证呼吸链复合物解离，或通过表型实验验证互作的生物学意义

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首个蛋白质组水平无偏倚靶点筛选方法⬅️⬅️⬅️

▶ 全面直接筛选真实药靶组合：蛋白质组水平筛选药物结合的蛋白靶点，全面覆盖治疗靶点与脱靶靶点；使用药物分子本体进行试验，无需设计合成分子探针，药靶结合更真实

▶ 多种数据分析策略：结合蛋白热变性曲线分析和非参数分析方法（NPARC），全面捕获潜在药物靶点

▶ 多种生信分析数据库挖掘辅助筛选：对潜在药物靶点进行生信分析与数据库挖掘，辅助最终药物靶点的确认

▶ 多种衍生技术可选：除常规温度范围（TPP-TR）、药物浓度范围（TPP-CCR）、两者结合（2D-TPP）的常规热蛋白组分析方法外，还可进行单温度点（ITSA）、多温度点混合（PISA）等高通量热蛋白组分析方法

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参考资料

[1] Zhang S, Li FM, Wang J, et al. Integrated thermal proteome and thermal proximity co-aggregation profiling identifies ATP6V1C1 as a novel anti-cancer drug target. Int J Biol Sci. 2025;21(7):3197-3213. Published 2025 Apr 28. doi:10.7150/ijbs.106843

[2] Sun S, Zheng Z, Wang J, et al. Improved in situ characterization of protein complex dynamics at scale with thermal proximity co-aggregation. Nat Commun. 2023;14(1):7697. Published 2023 Nov 24. doi:10.1038/s41467-023-43526-2

[3] Teitz J, Sander J, Sarker H, Fernandez-Patron C. Potential of dissimilarity measure-based computation of protein thermal stability data for determining protein interactions. Brief Bioinform. 2023;24(3):bbad143. doi:10.1093/bib/bbad143