RNA-seq

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原创 最新推荐文章于 2025-10-22 13:05:51 发布 1.7k 阅读 AI 写同款· GEO 优化 ›
RNA-seq数据分析（分析策略，比对，转录组组装，转录本定量） 分析策略通过综合分析RNA-seq分析流程中不同步骤的工具性能发现不同的分析工具和方法对分析结果的准确度和分析时间影响巨大。HISAT2表现出最快的速度和最准确的拼接比对，但是没有STAR的敏感度高。StringTie在速度和准确度上都优于Cufflinks。长读段方法如IDP和Iso-Seq会识别许多短读段技术没有识别到的多外显子转录本，但是会丢失一些单外显子转录本。通常，在从头组装工具中，Oases表现最佳。不经过比对的工具如和kallisto。 阅读详情

RNA-seq（RNA测序）是一种用于分析转录组的方法，能够对生物样品中的RNA分子进行定量和定性分析。

主要流程包括样品采集、RNA提取、建库、测序和数据分析，具体过程如下：

1. 样品采集和RNA提取

  • 样品采集：RNA-seq通常使用细胞或组织样品。取样时需要迅速冻结样品，防止RNA降解。样本采集方法和质量对最终数据质量影响较大，因此采集要规范。

  • RNA提取：使用专门的试剂盒或试剂提取总RNA，常用的提取方法包括TRIzol法和柱式提取法。提取后需要检测RNA的质量，确保RNA没有明显降解（通过电泳或Bioanalyzer检测RNA的完整性，RIN值通常要求≥7）。

2. 建库准备

  • mRNA富集或rRNA去除：为了专注于mRNA，常需进行富集或去除操作。真核生物通常富集poly(A)+ mRNA（通过poly(T)磁珠捕获mRNA）；若研究非编码RNA或更广泛的转录组，可能会选择rRNA去除方法。

  • 反转录生成cDNA：通过逆转录酶将RNA转化为cDNA。这是因为RNA不稳定，而cDNA相对稳定且适合于后续测序。

  • 文库构建：文库构建包括cDNA片段化、末端修复、加接头和PCR扩增等步骤。片段化通常通过物理法（如超声）或化学方法完成。之后在片段两端加上接头，方便与测序仪连接。扩增后的文库经过质量控制（如Qubit定量和Bioanalyzer片段长度检测）后才能进入测序。

3. 数据量确定

RNA-seq的数据量决定了研究的分辨率和覆盖度，通常根据实验目的来确定：

  • 差异基因表达分析：一般每个样本20-50 M（百万）reads即可满足。

  • 转录组组装：新物种或无参考基因组物种，建议更高的测序深度（≥100 M reads）。

  • 等位基因表达分析：对比等位基因表达的研究可能需要更高的reads数，以检测较低丰度的转录本。

  • 数据量通常根据样本数量和目的设计平衡测序成本和数据精度。

4. 上机测序

  • 测序平台选择：常用的测序平台包括Illumina（如HiSeq、NovaSeq）、PacBio和Oxford Nanopore等。Illumina测序精确度高且数据量大，适合RNA-seq，而长读长平台（如PacBio和Nanopore）适合于更复杂的转录本结构解析。

  • 测序流程：将建好的文库加载到测序仪器上，生成raw data（原始数据）。不同平台的测序时间不同，Illumina通常几天内完成，而长读长平台可能需要更长时间。

5. 下机数据处理

下机后数据分析步骤包括：

  • 数据质量控制（QC）：去除低质量reads和接头序列，以保证数据质量。通常使用FastQC检查数据质量，使用Trim Galore等工具进行质量剪切。

  • 比对或组装：

    • 比对：若有参考基因组，将reads比对到参考基因组上。常用的比对工具有STAR、HISAT2等。

    • 组装：若无参考基因组，可使用Trinity、SPAdes等软件对转录组进行de novo组装。

  • 定量分析：比对完成后，计算每个基因或转录本的表达量。常用的定量方法包括FeatureCounts（计数reads）和Salmon/Kallisto（准比对）。

  • 下游分析：包括差异基因表达分析、基因功能注释、通路分析、可变剪接分析等。这些分析可以深入探讨基因调控机制、疾病相关基因和信号通路等生物学问题。

RNA-seq技术灵活，数据分析丰富，可用于多个研究领域，如基因表达、转录本结构变异、非编码RNA分析等，为研究基因表达和调控提供了高分辨率的工具。

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RNA_seq生物分析学习--RNA-seq介绍 目录第一课 课程介绍第二课 RNAseq技术第三课 RNAseq发展历史第四课 关于基因的概念第五课 RNAseq样品提取与处理 第一课 课程介绍 RNAseq捕获了细胞某一状态下所有的转录信息 DNA是静态信息、RNA是动态信息，是某一时刻DNA表达谱的快照 课程大纲 RNAseq的应用 第二课 RNAseq技术 转录组概念 中心法则（高通量测序验证了中心法则是正确的） mRNA是编码RNA、其余RNA称为非编码RNA。（非编码RNA由基因组上非基因区转录出来）人类基因组上只有10%是基因区， 阅读详情

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