从零开始，手把手教你WB实验全过程

WB即Western Blot，蛋白质免疫印迹。是一种基于抗原抗体的特异性结合，半定量检测样品中某种蛋白的技术。作为分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种经典实验方法，WB虽看似简单，却常因各种因素做不出好看的结果图，甚至拿不到结果。今天，伯小医就带领大家从头开始，一整个过一遍超详细的实验流程，保管你一学就会，结果图好看的让人敬佩！

1、实验原理

WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物（NC膜或PVDF膜），并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物（即总蛋白混合物）中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型（如亚型、聚体、剪切体等）和蛋白表达量的变化。

2、实验步骤

2.1蛋白提取

（1）准备：明确所检测目的蛋白的表达情况，有些蛋白可能只在部分细胞或者组织中表达，有些蛋白可能需要刺激才能表达或表达量增加，可通过已发表文献或者在线数据库如Uniport、NCBI和BIOGPS等，了解所研究蛋白的特点，正确选择和处理样本。

（2）蛋白提取：蛋白提取是WB实验的开端，裂解液的选择、样本的破碎方法、温度和变性等都会影响样本蛋白是否提取成功。蛋白提取整个过程都需严格在冰上操作，以减少高温造成的蛋白降解；若是磷酸化蛋白检测，提取液中需加磷酸酶抑制剂混合物。

下表是一些常见的不同类型样品的处理方法：

2.2蛋白浓度测定

取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。蛋白质浓度测定的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法和胶体金法。目前BCA法是广泛使用的蛋白定量方法，原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。

2.3制备SDS-PAGE凝胶

SDS-PAGE的目的是根据蛋白质的大小分离蛋白质。

SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子洗涤剂，由亲水的头基和疏水的尾基组成。因此，当溶解时，它的分子在很宽的pH范围内形成净负电荷。将SDS添加到蛋白质中使蛋白质变性，并使其具有均匀分布的净负电荷。这就使蛋白质在电泳过程中向正极迁移。

PAGE（聚丙烯酰氨凝胶电泳）是丙烯酰胺单体的聚合物，当这种聚合物形成时，它会变成凝胶，用电将蛋白质拉过凝胶，就会根据蛋白的大小很好的将蛋白分开。凝胶是由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.8，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.8。

根据目标蛋白分子量大小、表达位置和样本数量确定分离胶和浓缩胶浓度、凝胶厚度和数量。

2.4上样电泳

知道每个样的蛋白浓度后，在上样时候保证一个泳道的蛋白总量为30μg（根据具体情况而定，一般不超过30μg）。同时需要保证每一个泳道上样体积保持一致，可用loadding buffer补足（可上30μL）。浓缩胶使用100V电压进行电泳，一般是30min（具体根据buffer是否到达浓缩胶与分离胶的交界处），进入分离胶以后可提高电压至150V进行电泳（一般1h），然后轻轻的将SDS-PAGE多余部分切割，浓缩胶与分离胶的交界处即可。

2.5转膜

目前WB转膜方法有湿转法和半干转法。半干转法，转膜时间短，速度快，所需缓冲液更少，但是干燥条件下转膜容易失败。湿转法，是比较常用的转膜方法，相较于半干转法，条带更稳定。

湿转法转膜一般是在转膜仪的负极（黑面），依次放入海绵、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵（类似三明治结构），每放一层都要赶尽气泡，使滤纸与胶、胶与膜、膜与滤纸完全贴合。放好后，加满4℃预冷的转膜液，设置转膜仪，充分把握好转膜的时间，时间过长会导致蛋白条带从PVDF膜上穿透除去。

注意：转膜时胶在负极，膜在正极，不能放反，接通电源时亦不能反，否则蛋白就转到滤纸上了；冰浴湿转效果更好；制作转膜三明治时，一定要赶尽气泡，否则有气泡的地方蛋白结合不到膜上，显影时膜上会出现气泡。

WB转印膜有硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜和PVDF膜，目前常用的有NC膜和PVDF膜。在转膜过程中，膜的选择非常重要，PVDF膜有各种孔径尺寸，最常见的是0.45μm和0.2μm，对于蛋白理论大小大于20KDa，一般建议使用0.45μm的PVDF膜，反之选择0.22μm的PVDF膜。

转膜时间太长或太短，蛋白质已经转走或还未吸附到膜上。做WB实验前，需要明确目标蛋白的分子量，根据文献确定转膜的时间。

2.6封闭

转膜完成后，将PVDF膜取出，放入TBST中洗涤5min，转入封闭液（5%脱脂奶粉或BSA）中室温封闭1h。

2.7一抗孵育

参照抗体说明书的WB稀释比例，用抗体稀释液稀释好一抗，将膜从封闭液中夹出用滤纸吸去多余液体，放入抗体孵育盒中，倒入稀释好的一抗，过夜孵育。

2.8二抗孵育

根据一抗来源选择合适的二抗，参照抗体说明书的WB稀释比例，用抗体稀释液稀释好二抗。将一抗孵育的PVDF膜用TBST洗涤3次，每次5min，将膜从洗涤液中夹出用滤纸吸去多余液体，放入抗体孵育盒中，倒入稀释好的二抗，室温孵育1h。

2.9洗涤

TBST洗膜3次，每次5min。

2.10显影曝光

取等体积ECL发光液A液与B液，混匀后避光保存备用。将PVDF膜放入盛有显影液的暗盒中孵育5min，孵育的过程中不停的轻轻摇晃暗盒。然后置于仪器中曝光拍照。

2.11结果展示

 参考文献

Lin JS, Lai EM. Protein-Protein Interactions: Co-Immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 2017;1615:211-219.

Isono E, Schwechheimer C. Co-immunoprecipitation and protein blots. Methods Mol Biol. 2010;655:377-87.