医疗器械中生物膜的耐药性

医疗器械中生物膜的抗菌素耐药性

J. 马利罗, M. 西蒙斯 波尔图大学, 波尔图, 葡萄牙

4.1 引言

关于生物膜存在的首次记录证据可能由亨里奇于1933年提供。亨里奇注意到，水中的细菌并非自由漂浮，而是生长在浸没的表面上（Bose 和 Ghosh，2011；Henrici，1933）。事实上，生物膜可以被描述为附着在表面或彼此附着并嵌入胞外多糖基质中的微生物群落（Bose 和 Ghosh，2011；Taraszkiewicz 等，2013）。该基质还包含由细胞产生的胞外聚合物。与相应的浮游细胞相比，生物膜内的细菌表现出改变的表型，尤其是在生长、基因转录、蛋白质产生和细胞间相互作用方面（Otter 等，2015）。此外，生物膜内的细胞表现出较低的代谢活性，这限制了抗菌剂的作用（Taraszkiewicz 等，2013；Donlan，2001b）。

在医疗环境中，生物膜的形成极为棘手，因为已知它们与65%的医院获得性感染有关，并且常在医疗器械和假体、水管和管道以及内窥镜和伤口上被检测到（Otter et al., 2015; Taraszkiewicz et al., 2013）。

无论患者的免疫系统如何，生物膜感染都很难得到控制。即使是抗生素，也仅对从生物膜中释放出的浮游细胞有效。因此，控制生物膜感染最常见的治疗方法是移除植入装置或清除在活体组织中形成的生物膜（Taraszkiewicz 等，2013）。医疗相关感染（HCAIs）是由多种微生物引起的，例如革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌）以及革兰氏阴性杆菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌）（Donlan，2001b；Percival 等，2015）。然而，最重要的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），其在临床环境中可引发多种败血症或菌血症（Percival 等，2015）。过去许多与医疗器械相关的感染被认为是单微生物的。然而，随着生物膜研究的进展，发现大多数感染实际上是多微生物的。这些生物膜已在静脉导管和导尿管、植入物、支架、呼吸机管路、脑脊液分流管和心脏瓣膜中被发现（Peters 等，2012；Desai 等，2014）。其中一个主要的多微生物污染的例子是肠外营养喂养管（Peters 等，2012）。

评估医疗器械污染的方法包括微生物培养，或更先进的显微镜技术，如共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）（Donlan，2001a；Mihai 等，2015）。其他可选技术还包括荧光原位杂交以及基质辅助激光解吸与飞行时间分析质谱联用（MALDI‐TOF）（Suleman 等，2014）。

由于定植微生物表现出的抗菌素耐药性，医疗器械中生物膜的形成日益引起关注。如今，一些细菌已因其对抗菌药物的多重耐药性而为人所知，并被视为超级细菌。主要的临床相关超级细菌包括金黄色葡萄球菌、肠球菌、肠杆菌科、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌（Niveditha 等，2012）。为解决这一问题，目前正在开发新的策略，优先预防生物膜形成，例如对器械表面进行改性或涂层处理（科奇斯等人，2016）。

本章阐述了在医疗器械中形成的生物膜内微生物所表现出的抗菌素耐药性问题。首先，对生物膜的形成与结构进行了概述，随后介绍了目前最重要且被广泛接受的生物膜耐药机制。根据医疗器械所暴露的污染程度，对其进行了分类说明。此外，详细介绍了导致大多数医院感染尤其是与医疗器械相关的感染的常见病原体。本章最后一部分综述了科学界关于与医疗器械相关的生物膜耐药性的最新进展。

4.2 生物膜——形成、结构与耐药性

4.2.1 形成与结构

生物膜形成包括早期、中期和成熟阶段。在第一阶段，浮游细胞通过鞭毛沿表面移动，或通过体液被动转移。这种表面识别之后是微生物的黏附（可逆附着），形成单层细胞（Taraszkiewicz 等，2013）。该附着过程可能受到多种因素促进，例如增强的剪切力、细胞运动性和细菌与表面之间的静电相互作用（Percival 等，2015；科斯塔基奥蒂等人，2013）。在早期阶段，细菌仍对抗生素敏感。在中期阶段，细菌不可逆地结合到表面，增殖并形成微菌落，进而负责产生胞外聚合物基质。此时，生物膜开始明显区别于浮游细胞，并具备抵抗机械力和抗菌剂等外界因素的能力（Suleman 等，2014）。在生物膜形成的最后阶段，胞外物质的数量随着培养时间的延长而增加。这种结构可能会破裂，微生物可迁移至其他表面并扩大感染。有多种因素可促进这种扩散，例如营养物质、氧气可用性和温度的变化（Percival 等，2015；科斯塔基奥蒂等人，2013）。通常，生物膜的形成受群体感应机制调控，并且例如会因营养缺乏、表面形态和组成以及细菌运动性而增强（Bose 和 Ghosh，2011）。群体感应机制包括化学信号分子的产生、释放和检测，从而实现微生物细胞间的通讯（Taraszkiewicz 等，2013）。

4.2.2 抗菌素耐药性

抗菌素耐药性是一个源于需要预测某种抗菌药物是否对特定感染和/或病原体有效的概念。因此，已制定了临床定义，例如欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）的定义。在这种情况下，如果微生物的最低抑菌浓度高于或低于标准化值，则可根据该值将其分类为对某种抗菌药物敏感、中介或耐药（Jones 和 Howe，2014）。敏感性测试具有实用性，因为它提供了有关耐药性的信息，从而有助于预测临床结果（Doern 和 Brecher，2011）。某些微生物由于靶点缺失或不通透性等原因，天然对特定抗菌药物敏感或耐药。例如，革兰氏阳性菌由于缺乏外膜，因此天然对多粘菌素E耐药（Li 等，2005）。此外，革兰氏阴性菌由于大分子物质如万古霉素（糖肽类）无法穿透其外膜，因而对此类药物天然耐药（Russell，2003）。相反，原本天然敏感的细菌也可能获得抗菌素耐药性。根据EUCAST，这导致微生物被定义为野生型和非野生型。

通过在特定表型检测系统中应用适当的临界值，可确定某物种的微生物是否属于野生型。在这种情况下，临界值在任何情况下均保持不变。而非野生型微生物则因存在针对测试抗菌药物的获得性或突变性耐药机制，导致对该抗菌药物的临床反应不确定（Jones 和 Howe，2014）。

由生物膜引起的感染难以治疗，尤其是由于定植群落的特性，与浮游细胞相比，对抗菌化学物质的耐药性显著增加（敏感性降低约1000倍）（Taraszkiewicz 等，2013；Percival 等，2015；Desai 等，2014）。与生物膜相关的感染通常对多种抗菌剂呈难治性，最常见的机制包括：生物膜基质导致的扩散限制；生理梯度的形成，从而产生微环境，进而导致细胞表型异质性以及与生物膜相关的表型，如细菌持留或休眠，以及对不同条件的遗传适应（Humphreys 和 McBain，2014；Percival 等，2015；Taraszkiewicz 等，2013）。靶位点修饰、抗菌药物修饰酶和外排泵也是微生物耐药性的三种重要机制，当它们的表达因周围微环境的变化而上调或下调时，可被视为表型改变；而当这种修饰/酶/外排泵在野生型微生物中原本不存在时，则属于遗传适应；因此，其表达发生在突变或其他微生物的基因获取之后（Joes 和 Howe，2014）。

基质是由酶和胞外聚合物组成的异质层，占生物膜的90%（Taraszkiewicz 等，2013；Suleman 等，2014）。基质是导致生物膜顽固性的因素之一，因为它能够通过延缓扩散（反应扩散限制）直接与大多数抗菌剂相互作用，通过酶的作用使抗菌剂失活（酶介导的扩散限制），并作为阳离子抗菌剂和抗生素的淬灭剂（Stewart，1996；Humphreys 和 McBain，2014）。此外，它还能防御紫外线和脱水，因此基质可充当物理和化学屏障（Percival 等，2015；Desai 等，2014）。

生物膜的异质性导致微环境中营养物质和氧气的可用性不同，这可能影响生长和代谢速率，从而导致具有不同代谢状态的微生物存在（Percival 等，2015）。这一点体现在群体感应信号和有毒产物积累上（Subramanian 等，2012）。部分微生物处于静止期，可能会降低其对抗菌剂的敏感性。事实上，这些细菌被认为是持留细胞，它们本身并不对抗生素具有内在抗性，但因其与生物膜的关联，能够在抗生素治疗中持续存在（Subramanian 等，2012；Humphreys 和 McBain，2014；Kim 等，2009）。

最后一种假说认为，由于生物膜内细胞的突变频率和质粒交换率高于浮游状态，因此存在对不同条件的遗传适应。因此，另一种重要的抗菌剂耐药机制是靶位点修饰，即通过修饰靶位点使化学结合效率降低（Lewis，2008）。在另一种机制中，微生物能够产生氨基糖苷类修饰酶，从而使其能够灭活或修饰抗菌剂（Gordon 和 Wareham，2010）。通透性障碍机制基于细菌包膜的修饰，使得化学物质无法渗透至其作用位点。外排泵的存在也是生物膜抗菌耐药的重要机制之一，因为化学物质可通过外排泵从细菌胞质中被主动排出（Jones 和 Howe，2014；Sun等，2013；Sheldon，2005）。目前，外排泵可分为五个家族：多药及毒性化合物外排、ATP结合盒（ABC）、金黄色葡萄球菌多重耐药（SMR）、耐药调控家族（RND）和主要易化子超家族（MFS）（Humphreys 和 McBain，2014）。此外还有其他多种机制可导致细菌对抗菌剂的耐药性，但这些机制并不十分常见。事实上，细菌能够保护其靶位点，或阻碍活性药物的形成（Jones 和 Howe，2014；Sheldon，2005）。

4.3 与医疗器械相关的感染

4.3.1 医疗器械

医疗专业人员在选择医疗器械时必须考虑多个问题。这种选择主要基于治疗效果、成本以及感染风险。导管（中心静脉和尿道导管）以及气管插管和饲管（表4.1）被认为是常用的医疗器械（Cooper 等，2014）。

有大量种类的血管内装置通过皮肤插入呼吸系统血管，用于输送药物、液体或营养产品。这些装置还可测量血液和肺动脉压，并便于抽取血样进行分析（Raad 等，2007）。此类装置相关的感染可局部发生于插入部位，直至静脉和周围组织，引起静脉炎。如果微生物进入循环系统，可能引发全身性败血症。

为避免严重感染，长期使用的血管内装置在进入中心静脉前，会先穿过皮肤隧道植入。这种情况下，伤口愈合可减少微生物从装置外部迁移导致的感染风险（Khardori 和 Yassien，1995；Cooper 等，2014）。生物膜形成既可发生在导管外部分，也可发生在管腔内（Cooper 等，2014）。在导管插入后的一周内，管腔外生物膜被认为是与导管相关的血流感染的主要原因（Percival 等，2015；Donlan，2011）。相反，原位保留30天的血管导管则主要表现为管腔内定植（Raad 等，1993）。因此，需要长期导管进行静脉通路的患者具有较高的血流感染风险。Anaissie 等（1995）观察到早期感染发生在导管插入后一天内。事实上，他们指出这是一种普遍现象（Anaissie 等，1995）。中心血管导管更易引发败血症，因为它们通常是长期使用的医疗器械（Raad 等，1993）。

导尿管是乳胶或硅胶制成的管状装置，用于测量尿量、收集尿液、防止尿液滞留以及控制尿失禁（Percival 等，2015；Donlan，2001b）。对于接受导管插入的患者而言，装置每留置一天，与导管相关的感染风险就增加10%。这种导管一旦发生上行性定植，进而引发感染，便具有较高风险。事实上，80%的尿路感染与导尿管的使用有关（Percival 等，2015；Cooper 等，2014）。

气管插管采用聚氯乙烯制造，容易受到污染（Khardori 和 Yassien，1995）。因此，当患者插入气管插管并接受机械通气时，可在48–72小时内发生呼吸机相关性肺炎（VAP）。这种感染对医疗系统有重大影响，因为它导致住院时间延长以及住院成本增加（Palmer，2009）。插管术后发生VAP的死亡率为24–76%。根据住院时间少于或多于5天，VAP可依据感染风险分为早发性或晚发性（Percival 等，2015）。获得VAP的主要因素是气管插管，因为生物膜在这些材料上增殖非常迅速（24小时内）（Tarquinio 等，2014；Adair 等，1999）。

肠内营养管用于因神经或咽部疾病而无法咀嚼的患者，并且需要长期依赖这种支持。与肠外途径相比，选择肠内营养是因为其相关后遗症风险较低，因此可保留肠道的屏障、吸收和免疫功能（Hu 和 Zheng，2003）。无论使用何种类型的管道，这些喂养管都可能成为微生物沿管道迁移至胃部的途径。因此，管道中可能形成菌群失调以及生物膜（Peters 等，2012；Bankhead 等，2009）。当患者接受人工喂养时，胃部菌群的多种固有抗性机制会遭到破坏。

使用这些管道的后果之一是缺乏与进食相关的某些刺激，导致唾液分泌和蠕动运动受到抑制，进而引起pH升高和胃亚硝酸盐浓度降低。所有这些事件的综合效应导致胃和十二指肠中出现微生物过度生长，且对抗生素治疗具有难治性（Peters 等，2012）。

4.3.2 医疗保健相关感染

医院获得性感染是指在医院接受直接医疗护理或治疗过程中引发的感染（Suleman 等，2014）。最常见的医院获得性感染包括呼吸机相关性肺炎、中心导管相关性败血症、尿路感染、艰难梭菌感染和手术部位感染。这些感染已被广泛研究，某些细菌和真菌已被证实与医院获得性感染有关。在临床环境中，已在导尿管、脑室引流管、乳房植入物和人工耳蜗植入物上观察到生物膜生长。

事实上，留置医疗器械的定植约占美国医院获得性感染的50%（Humphreys 和 McBain，2014）。此外，涉及生物膜的留置医疗器械感染估计在心室辅助装置中占40%，心脏植入物中占4%，关节假体中占2%，而在长期导尿术中几乎达到100%（>28天）（Donlan，2001b）。

4.3.3 医疗器械中最常见的污染

与医疗器械相关的感染给医院服务带来巨大的经济负担，并增加了患者发病率和死亡率（Donlan，2008）。

最初的污染通常是由少量微生物引起的，这些微生物通过患者或医护人员的皮肤、受污染的水或其他外部来源与医疗器械接触（von Eiff等，2005）。

与医疗器械相关的感染中，近80%的细菌为表皮葡萄球菌。该细菌与金黄色葡萄球菌是医用材料中生物膜感染最常见的微生物，被认为是医院获得性感染的主要来源（Percival 等，2015）。每种医疗器械最常见的相关微生物列于表4.2中。

医疗器械	微生物	参考文献
中心静脉导管	表皮葡萄球菌, 金黄色葡萄球菌, 白色念珠菌, 铜绿假单胞菌, 肺炎克雷伯菌，和 粪肠球菌	唐兰（2001b） 和 库珀等人（2014）
导尿管	表皮葡萄球菌，粪肠球菌，大肠杆菌,奇异变形杆菌, 铜绿假单胞菌,肺炎克雷伯菌, 鲍曼不动杆菌, 和 白念珠菌	唐兰（2001b），珀西瓦尔 等人（2015），辛哈伊 等人（2012），和 亚当等人（2002）
气管插管	铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，奇异变形杆菌，肺炎克雷伯菌，肠杆菌，粪肠球菌，不动杆菌 spp.，以及 真菌 白念珠菌	阿代尔等人（1999） 和 鲍尔等人（2002）
肠内营养	肠球菌、葡萄球菌，假单胞菌,芽孢杆菌, 和 Candida spp.	道特尔等人（2002年） 和 梅霍尔等人（2002年）
## 4.4 医疗器械中的生物膜：耐药性

4.4.1 检测与诊断

与生物膜感染相关的感染症状包括发热和特定部位持续存在的炎症反应。当出现这些信号时，需进行额外检测以确定感染原因（Mihai 等，2015）。目前临床环境中可用于识别生物膜的方法较少。最常用的微生物学方法是平板计数法，即将在医疗器械上采集的拭子样本接种于琼脂平板上培养，并测定菌落形成单位。然而，该方法存在多种缺点，例如无法提供有关生物膜成熟度和异质性的信息。因此，如今最常用的技术是使用特异性荧光标记的显微镜技术。其他先进的显微镜方法，如扫描激光显微镜、SEM 和 AFM，可用于确定生物膜形态、细胞‐表面附着以及原位细胞间相互作用（Donlan，2001a；Lindsay 和 von Holy，2006；Wu 等，2015；Mihai 等，2015）。

这些方法的长时间周期促使人们开发替代技术以确定感染来源，例如荧光原位杂交以及与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI‐TOF）联用的基质辅助激光解吸（Suleman 等，2014）。

4.4.2 生物膜耐药性的后果：超级细菌

对抗菌素耐药性的研究常常忽视持留细胞作为生物膜顽固性的原因，尤其是因为这些细胞能够在长期抗生素暴露下存活，并在环境胁迫消失后转变为生长状态。因此，其临床意义在于，持留细胞可能与慢性或复发感染相关，同时也可被视为由于其对抗菌药物的耐受性而产生的耐药突变体的储存库（Humphreys 和 McBain，2014）。

对与留置医疗器械相关的生物膜细胞的研究表明，耐药性问题确实存在，如表4.3所列示例所示。这些示例指出，从医疗器械中的生物膜中分离出的微生物，或在类似实际条件下培养的微生物，对抗菌剂的敏感性较低。

医学界对某些细菌的日益关注促使了超级细菌概念的形成。超级细菌是指对极少抗菌剂敏感、具有特殊致病性或易于传播并因此在医疗机构中引起暴发的细菌（Jones 和 Howe，2014）。主要的临床相关超级细菌包括 S. aureus 、肠球菌、肠杆菌科、 P. aeruginosa 和 A. baumannii （Niveditha 等，2012）。它们的耐药性已在表4.3所列的多个病例中被观察到。

金黄色葡萄球菌感染主要与软组织感染有关，但也可导致某些侵入性感染，死亡率范围为20–30%（Corey，2009；Dancer，2008）。金黄色葡萄球菌对多种抗菌剂天然敏感，例如 β‐内酰胺类、糖肽类、大环内酯类、四环素、克林霉素和氨基糖苷类。然而，多年来已获得多种耐药机制，例如产生 β‐内酰胺酶以灭活 β‐内酰胺环，或获得编码修饰的青霉素结合蛋白（对 β‐内酰胺类天然耐药）的基因，这种情况见于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌（Llarrull 等，2009）。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在全球范围内的传播是金黄色葡萄球菌定植流行病学、医院中抗菌药物和抗生素的滥用以及感染控制基本措施存在疏漏的结果（Dancer，2008）。

肠球菌是健康成人下消化道正常菌群的一部分。最常见的种类是粪肠球菌和屎肠球菌，也是主要的感染病原体。10%至15%的自体瓣膜心内膜炎由肠球菌引起，它们还可引发由尿路感染导致的菌血症（Alberici 等，2015；Jones 和 Howe，2014）。肠球菌对多种抗菌药物具有天然耐药性。它们对头孢菌素耐药，并且由于产生低亲和力的青霉素结合蛋白，对青霉素、阿莫西林和碳青霉烯类具有低敏感性（Rathnayake 等，2012）。

肠杆菌科是一大类革兰氏阴性杆菌，属于人和动物胃肠道的共生菌群。其中多个物种为机会致病菌，最常见的尿路致病菌是大肠杆菌（Alberici 等，2015）。该菌属还包括其他一些物种，如克雷伯菌 spp.、阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌。由于肠杆菌科为革兰氏阴性菌，具有外膜结构，可阻止大分子（如万古霉素和达托霉素）以及多种青霉素的渗透（Ruppé 等，2015）。

铜绿假单胞菌 是一种机会致病菌，因其能够在营养受限和多种环境条件下存活和生长，并且对多种抗菌药物具有固有耐药性。如前所述，铜绿假单胞菌 是一种革兰氏阴性细菌，因此其具有外膜，可赋予其对多种抗菌剂（如 β‐内酰胺类）的固有耐药性。该菌对青霉素和头孢菌素的耐药性是由通透性降低、低亲和力青霉素结合蛋白、β‐内酰胺酶产生以及外排作用共同导致的（Smith 等，2013）。水平基因转移虽然重要，但强效 β‐内酰胺酶的获得主要通过染色体突变介导，这些突变可调节固有耐药机制的表达，例如外排泵（Vestergaard 等，2016；Ruppé 等，2015）。

另一种机会致病菌是鲍曼不动杆菌，尤其是在医院的重症监护室中。鲍曼不动杆菌与多种医院感染和暴发有关。事实上，最常见的感染是呼吸机相关性肺炎。该细菌的耐药机制尚未被广泛研究。尽管如此，已知鲍曼不动杆菌的外膜比大肠杆菌的外膜通透性更低。这是由于存在孔蛋白以及外排泵的组成型表达所致，这些因素导致其对β‐内酰胺类、氨基糖苷类、β氯霉素、喹诺酮类、四环素和替加环素等抗菌剂产生耐药性（Ruppé 等，2015；Peleg 等，2008）。

白色念珠菌是Candida属中最常见的病原体。事实上，与导管相关的所有医院内血流感染中有10%是由Candida属引起的败血症。其他医疗器械也会被 Candida定植，例如导尿管、人工心脏瓣膜和起搏器（Adam等，2002）。酵母细胞难以治疗的主要原因是生物膜相对于浮游细胞的耐药性增强，以及与生物膜相关的毒力基因的转录变化（Samaranayake等，2015）。Candida的生物膜对临床抗真菌药物如两性霉素B和氟康唑表现出耐药性（Ramage等，2001）。

4.4.3 生物膜预防

由于抗菌素耐药性导致生物膜难以根除，促使人们寻找新策略。其中一种方法是利用现有的抗生素和抗菌剂开发新的治疗选择，以避免生物膜形成以及耐药菌群的出现（Sun等，2013）。另一个日益受到重视的假设是预防生物膜形成。在这种情况下，最常见的策略是对医疗器械进行表面改性，通过改变所用材料或开发涂层来实现。相关方法示例见表4.4。

医疗器械	策略	参考文献
钛植入物	钛植入物的表面处理 实现了局部可控递送 镓或银离子而没有 耐药性的发展和 保持高骨整合性 潜力。	科希斯等人（2016）
中心静脉导管	中心静脉导管涂有 防腐剂氯己定和 磺胺嘧啶银降低 定植的风险。	奥斯滕多夫等人（2005）
米诺环素‐利福平浸渍的 中心静脉导管降低 导管相关感染的风险。	查齐尼科拉乌等人（2003年） 和 Hanna等人 (2004)
导尿管	N,N′‐(1,2‐苯基)二马来酰亚胺‐ 加PS涂层的硅胶导管 显示出对抑制率为40.9%和35.6% 对 P. aeruginosa 和 S. epidermidis 的黏附，分别。	伯顿等人（2006年）
导管	固定化液态全氟碳 管路和导管的表面涂层 抑制生物膜形成。	莱斯利等人（2014）

4.5 结论

医疗器械上形成的生物膜对公共卫生构成巨大威胁，特别是对于需要使用留置医疗器械的患者。由于内在和获得性耐药机制，生物膜中的微生物很难通过抗菌剂进行控制。此外，生理梯度以及基质扩散限制也加剧了对抗菌剂的抗菌素耐药性。生物膜顽固性最重要的方面之一是持留细胞，由于其处于休眠代谢状态，这些细菌对抗菌剂的敏感性较低，并能够重新定植于新的表面或进入血液引起败血症。已在最常见的医疗器械中分离出多种多重耐药微生物，例如 S. aureus 、肠球菌、肠杆菌科、 P. aeruginosa 和 A. baumannii 。目前广泛探索的一种应对医疗器械中生物膜形成问题的新策略是表面改性或涂层，以防止微生物附着，而不是治疗已形成的成熟生物膜。