线粒体代谢干预同步增强肿瘤光热与光动力效应

光热疗法与光动力疗法作为新兴的肿瘤干预手段，凭借其时空精准性和微创特性受到广泛关注。前者通过光激发产生局部高温破坏肿瘤细胞，后者则依赖光敏剂在光照下生成活性氧物种诱导细胞损伤，二者机制互补，联合应用可显著提升肿瘤干预效果。然而，肿瘤细胞的异常代谢特性为这两种疗法的高效发挥设置了天然障碍：一方面，热应激下肿瘤细胞会过量表达依赖 ATP 的热休克蛋白，通过修复热损伤增强自身耐热性，削弱光热效应；另一方面，肿瘤细胞无限增殖过程中活跃的氧代谢导致微环境严重缺氧，限制了光动力疗法中氧依赖的活性氧生成。​

针对这些问题，现有策略多聚焦于直接抑制热休克蛋白或补充肿瘤微环境氧含量，但前者仅能作用于已合成的热休克蛋白，无法从源头阻断其表达，后者则面临内源性底物不足、外源性氧释放效率低下等问题。近年来，线粒体代谢重编程成为突破这一困境的新方向。研究发现，肿瘤细胞虽以有氧糖酵解为主，但线粒体氧化磷酸化仍是其 ATP 的主要来源，电子传递链在这一过程中消耗大量氧气。若能有效干预线粒体电子传递链，不仅可减少 ATP 合成以抑制热休克蛋白的源头表达，还能降低氧耗改善肿瘤缺氧状态，从而同步增强光热与光动力效应。​

基于此，研究团队设计了一种新型线粒体靶向分子 BBR-LND，通过长链烷基将两种具有电子传递链抑制活性的成分连接，既保留了各自对电子传递链复合体 I 和 II 的抑制能力，又借助其中一种成分的线粒体靶向特性实现精准递送。为解决共递送问题，团队利用分子间非共价相互作用，将 BBR-LND 与光敏剂 ICG 通过一步自组装形成无辅料纳米粒（BLI NPs），该纳米系统不仅具有近 100% 的载荷率，还能通过肿瘤微环境的高通透性和滞留效应实现靶向富集，并在细胞内酸性环境下响应性释放活性成分。​

实验所用关键试剂中，2'，7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，Abmole）用于活性氧检测，其高纯度和稳定性确保了荧光信号的准确量化。合成 BBR-LND 的过程分为三步：首先通过真空高温处理使一种成分在 9 位发生选择性去甲基化，得到中间产物；随后在碳酸钾存在下与 8 - 溴辛醇发生亲核取代反应，延长烷基链；最后通过酯键将另一种成分偶联，经硅胶柱层析纯化得到目标产物，三步反应的产率分别为 85%、74% 和 65%，结构经核磁共振氢谱和高分辨质谱确证。​

BLI NPs 的制备采用一步自组装法：将 BBR-LND 与 ICG 按 1:2 质量比溶解于二甲基亚砜，超声处理后快速注入超纯水，搅拌 4 小时后离心纯化。透射电镜显示该纳米粒呈球形，平均粒径约 125 nm，分散系数低，zeta 电位为 - 27 mV，具有良好的胶体稳定性，在水和缓冲液中放置 120 小时后粒径无显著变化。元素 mapping 证实碳、氮、氧等元素均匀分布，傅里叶变换红外光谱和紫外 - 可见近红外光谱分析表明，组装驱动力源于静电相互作用、疏水作用和 π-π 堆积：其中一种成分的季铵阳离子与 ICG 的磺酸根形成静电结合，疏水链间的相互作用及芳香环的 π 堆叠进一步稳定结构。​

光热性能测试显示，在 808 nm 激光照射下，BLI NPs 的溶液温度随浓度和功率密度升高而增加，25 μg/mL 浓度在 1.5 W/cm² 功率下 5 分钟内可达 54℃，光热转换效率达 44%，且经过三次循环照射后仍保持稳定。光动力效应评估中，采用 1,3 - 二苯基异苯并呋喃作为单线态氧指示剂，发现 BLI NPs 组的吸光度下降速率显著快于游离 ICG 组，表明其能更高效地生成活性氧。光声成像实验证实，BLI NPs 的信号强度与浓度呈线性关系，在相同浓度下显著高于游离 ICG，为体内成像提供了可靠基础。​

药物释放实验表明，BLI NPs 在中性环境中释放缓慢，48 小时累计释放量仅 22%，而在 pH 5.0 的酸性条件下释放量可达 75%，透射电镜观察到酸性环境下纳米粒结构崩解，这种 pH 响应性释放特性有利于减少脱靶效应。细胞摄取实验中，流式细胞术显示 4T1 细胞对 BLI NPs 的摄取量随时间增加，6 小时达到饱和，且在 4℃时摄取量显著降低，证明其通过能量依赖的内吞途径进入细胞。共聚焦显微镜观察发现，孵育 1 小时后纳米粒主要定位于溶酶体，6 小时后则与线粒体标记物共定位，Pearson 系数随浓度升高而增加，表明释放的 BBR-LND 能有效靶向线粒体。​

电子传递链活性检测显示，BLI NPs 处理后 4T1 细胞的复合体 I 和 II 活性分别降低 60% 和 55%，显著高于游离成分组，线粒体超氧化物探针染色显示红色荧光强度增加 3 倍，证实电子传递链抑制导致活性氧大量产生。细胞耗氧率测定表明，BLI NPs 使基础呼吸和最大呼吸分别下降 95% 和 90%，ATP 水平降至对照组的 46%，Western blot 结果显示热休克蛋白 70 的表达量较游离 ICG 组降低 50%，说明 ATP 合成受阻有效抑制了热休克蛋白的表达。​

活性氧检测中，经 DCFH-DA 染色后，BLI NPs 联合激光组的荧光强度是游离 ICG 组的 4 倍，结合氧指示剂 RDPP 的结果可知，线粒体呼吸抑制减少的氧消耗提高了胞内氧浓度，为光动力反应提供了充足底物。细胞活性实验显示，BLI NPs 在激光照射下对 4T1 细胞的抑制率达 90%，凋亡检测中 Annexin V/PI 双阳性细胞比例达 64%，远高于其他处理组，而对正常内皮细胞的毒性显著较低，体现出良好的选择性。​

动物实验中，荧光成像显示 BLI NPs 在肿瘤部位的蓄积量是游离 ICG 的 3.4 倍，24 小时达到峰值，光声成像证实其能使肿瘤氧饱和度提升 13%。激光照射后，BLI NPs 处理组的肿瘤温度升至 47℃，活性氧染色显示强荧光信号。14 天干预后，该组肿瘤体积较对照组缩小 90%，3/5 的肿瘤完全消退，免疫荧光显示肿瘤组织中缺氧诱导因子 1α 和热休克蛋白 70 的表达显著下调，Ki67 阳性细胞减少，TUNEL 阳性细胞增加，且主要脏器无明显病理损伤，血液生化指标正常。​

综上，该无辅料自组装纳米系统通过线粒体代谢干预，同步解决了光热和光动力疗法面临的关键瓶颈，其设计理念为其他依赖氧或热效应的肿瘤干预策略提供了新思路。其中，DCFH-DA 在活性氧检测中的精准应用，为评估光动力效应的增强提供了可靠的实验依据，凸显了高质量试剂对研究结果可靠性的保障作用。这种基于分子自组装的多功能平台，不仅简化了纳米制剂的制备流程，还通过多机制协同显著提升了肿瘤干预效果，具有广阔的转化前景。