count转化为TPM

library(biomaRt)
#查看基因组参数
mart = useMart('ensembl')
listDatasets(mart)

#你需要哪个基因组,就复制它在dataset列里的词,放在下面这行的`dataset = `参数里
#此处以人类为例,植物参考注一
bmart <- biomaRt::useMart(biomart = "ENSEMBL_MART_ENSEMBL", 
                          dataset = "hsapiens_gene_ensembl",
                          host = "www.ensembl.org")

# 从输入数据里提取基因名
feature_ids <- rownames(expMatrix)##就是你需要ENSEMBL的例如ENSG00000000003


attributes = c(
  "ensembl_gene_id",
  #"hgnc_symbol",
  "chromosome_name",
  "start_position",
  "end_position"
)
filters = "ensembl_gene_id"

feature_info <- biomaRt::getBM(attributes = attributes, 
                               filters = filters, 
                               values = feature_ids, mart = bmart)
mm <- match(feature_ids, feature_info[[filters]])
feature_info_full <- feature_info[mm, ]
rownames(feature_info_full) <- feature_ids

# 计算基因的有效长度
eff_length <- abs(feature_info_full$end_position - feature_info_full$start_position)
feature_info_full <- cbind(feature_info_full,eff_length)

eff_length2 <- feature_info_full[,c(1,5)]

x <- expMatrix / eff_length2$eff_length

tpm = t( t(x) / colSums(x) ) * 1e6 

<think>我们正在处理用户的问题:如何将生信领域的count数据转化为RPM(ReadsperMillion)?根据引用[1]:RPM=totalexonreads/mappedreads(Millions)其中:-totalexonreads:某个基因(或外显子)的reads计数(即count数据)-mappedreads(Millions):该样本所有比对上的reads总数(以百万为单位)因此,计算RPM的步骤如下:1.对于每个样本,计算该样本中所有基因count之和(即总比对reads数)。2.将总比对reads数除以1,000,000,得到以百万为单位的总比对reads数(即mappedreadsinMillions)。3.对于每个基因,用该基因count除以步骤2得到的结果,即得到该基因的RPM。公式:RPM=(基因count)/(总比对reads数/1,000,000)=(基因count*1,000,000)/总比对reads数注意:RPM方法标准化了测序深度(即不同样本总测序量的差异),但没有考虑基因长度的影响。因此,它适用于比较同一个基因在不同样本中的表达水平,但不适合直接比较不同基因的表达水平(因为不同基因长度不同)。根据引用[2],我们可以使用featureCounts等工具得到count数据(每个基因count),同时也会得到每个样本的总比对reads数(通常包含在featureCounts的输出摘要中,或者可以自己计算每个样本的count之和)。因此,我们可以自己编写脚本(例如R或Python)进行转换,也可以使用现有的工具。下面给出两种方法:方法1:使用R语言计算步骤:1.读入count数据矩阵(行为基因,列为样本)。2.计算每个样本的总比对reads数(即每列的和)。3.对每个样本中的每个基因,使用上述公式计算RPM。示例R代码:```r#假设count_matrix是一个数据框或矩阵,行为基因,列为样本#计算每个样本的总reads数(百万为单位)total_reads<-colSums(count_matrix)/1e6#除以100万,得到百万为单位的总reads数#或者直接:RPM=count_matrix/total_reads(注意:这里total_reads已经是百万为单位,所以直接除)#但是我们需要对每个样本分别处理,所以可以使用sweep函数#方法:对每一列(即每个样本)进行归一化rpm_matrix<-sweep(count_matrix,2,total_reads,FUN="/")#或者更直接:#rpm_matrix<-t(t(count_matrix)/total_reads)#另一种方法:循环每个样本(更易懂)#rpm_matrix<-matrix(0,nrow=nrow(count_matrix),ncol=ncol(count_matrix))#for(iin1:ncol(count_matrix)){#rpm_matrix[,i]<-count_matrix[,i]/(sum(count_matrix[,i])/1e6)#}#然后将rpm_matrix的行名和列名设置好#注意:上面的total_reads是除以1e6后的,所以每个样本的总reads数(原始)为colSums(count_matrix),然后除以1e6得到以百万为单位的。#所以计算RPM时,用基因count除以这个以百万为单位的总reads数。```方法2:使用Python计算类似地,我们可以用pandas操作。示例Python代码:```pythonimportpandasaspd#假设count_df是DataFrame,行为基因,列为样本#计算每个样本的总reads数(以百万为单位)total_reads=count_df.sum(axis=0)/1e6#每列求和,然后除以100万#计算RPMrpm_df=count_df.div(total_reads,axis=1)#按列除,即每个样本的每个基因都除以该样本的total_reads(百万为单位)#输出rpm_df```另外,有一些生物信息学工具包也提供了RPM计算的功能,比如在R语言中,edgeR或DESeq2等包虽然主要用于差异表达分析,但也可以用于简单的标准化(但注意它们通常提供的是其他标准化方法,如RPKM、TPM等)。不过,RPM计算非常简单,通常自己写几行代码即可。注意事项:-确保count数据是原始计数(未经标准化)。-总比对reads数应该是该样本中所有比对到基因组(或外显子)的reads总数(不包括未比对的reads)。根据引用[1],RPM适用于miRNAseq等测序方法,因为miRNA长度相近,所以不考虑长度影响。对于mRNA-seq,通常使用RPKM/FPKM或TPM(考虑基因长度)进行标准化。因此,如果用户的数据是mRNA-seq,并且需要比较不同基因的表达,建议使用TPM而不是RPM。但是用户明确要求RPM,我们就按照RPM的方法计算。最后,生成相关问题:1.RPM与TPM、RPKM/FPKM有什么区别?2.在哪些情况下应该使用RPM而不是TPM?3.如何将count数据转化为TPM?4.使用RPM标准化后,如何进行差异表达分析?注意:用户的问题是关于RPM的计算方法和工具,我们已经回答。</think>### 生信 count 数据转化为 RPM 的计算方法 在生物信息学分析中,将 count 数据转化为 **RPM(Reads per Million mapped reads)** 是常见的标准化方法,其核心计算公式为: $$ \text{RPM} = \frac{\text{基因count }}{\text{样本总比对 reads 数}} \times 10^6 $$ #### 计算步骤: 1. **获取原始 count 数据** 从比对工具(如 `featureCounts`、`HTSeq`)输出的基因/外显子原始计数矩阵,行为基因,列为样本。 *示例数据格式*: | 基因 | Sample1 | Sample2 | |--------|---------|---------| | GeneA | 150 | 300 | | GeneB | 50 | 100 | 2. **计算样本总比对 reads 数** 对每个样本的 count 求和: $\text{Total Reads}_{\text{Sample}} = \sum(\text{所有基因count })$ *示例*: - Sample1 总 reads = 150 + 50 = 200 - Sample2 总 reads = 300 + 100 = 400 3. **计算 RPM ** 对每个基因count 应用公式: $\text{RPM}_{\text{基因}} = \frac{\text{基因 count }}{\text{样本总 reads}} \times 10^6$ *示例计算*: - GeneA 在 Sample1 的 RPM = $\frac{150}{200} \times 10^6 = 750,000$ - GeneB 在 Sample2 的 RPM = $\frac{100}{400} \times 10^6 = 250,000$ --- ### 常用工具与代码实现 #### 方法1:R 语言(推荐) ```r # 读取 count 数据(CSV 格式) count_df <- read.csv("count_matrix.csv", row.names = 1) # 计算 RPM 函数 calculate_rpm <- function(count_matrix) { total_reads <- colSums(count_matrix) / 1e6 # 转换为百万单位 rpm_matrix <- t(t(count_matrix) / total_reads) # 按列标准化 return(rpm_matrix) } # 执行计算 rpm_df <- calculate_rpm(count_df) write.csv(rpm_df, "rpm_matrix.csv", quote = FALSE) ``` #### 方法2:Python ```python import pandas as pd # 读取 count 数据 count_df = pd.read_csv("count_matrix.csv", index_col=0) # 计算 RPM total_reads = count_df.sum(axis=0) # 样本总 reads rpm_df = count_df / total_reads * 1e6 # RPM 公式 # 保存结果 rpm_df.to_csv("rpm_matrix.csv") ``` #### 方法3:命令行工具(如 `awk`) ```bash # 计算样本总 reads(假设 count 文件为 tab 分隔) awk -F'\t' 'NR==1 {print $0} NR>1 {for(i=2;i<=NF;i++) total[i]+=$i} END {for(i=2;i<=NF;i++) printf "\t%s", total[i]/1e6; print ""}' count_matrix.txt > totals.txt # 合并计算 RPM awk -F'\t' 'NR==FNR {if(NR>1) for(i=2;i<=NF;i++) size[i]=$i; next} NR>FNR {if(FNR==1) print $0; else {printf "%s", $1; for(i=2;i<=NF;i++) printf "\t%.2f", $i/size[i]; print ""}}' totals.txt count_matrix.txt > rpm_matrix.txt ``` --- ### 关键注意事项 1. **适用场景** RPM 适用于基因长度相近的分析(如 miRNA-seq),因其**未校正基因长度偏差**。对于 mRNA-seq,推荐使用 TPM 或 FPKM[^1]。 2. **数据要求** - Count 数据需为**原始计数**(非标准化)。 - 总 reads 数需排除低质量/未比对的 reads(需从比对工具日志中获取准确)。 3. **与 TPM 的区别** $$ \text{TPM} = \frac{\text{基因 count }}{\text{基因长度} \times \text{样本总 reads}} \times 10^6 $$ TPM 额外除以基因长度(kb),更适合 mRNA 分析[^1]。 --- ### 相关问题 1. RPM 与 TPM 在分析结果上会有哪些差异? 2. 如何将 RPM 标准化后的数据用于差异表达分析(如 DESeq2)? 3. 对于 miRNA-seq 数据,除了 RPM 还有哪些标准化方法? 4. 若总 reads 数包含重复 reads,对 RPM 计算结果有何影响? [^1]: RPM 方法标准化了测序深度的影响,但没有考虑转录本长度的影响。RPM 适合于产生的 read 读数不受基因长度影响的测序方法,比如 miRNAseq 测序。 [^2]: 使用 featureCount 等计算出 Count ,获得结果中就有对应的外显子长度。
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