嵌合型固相结合肽的设计与应用

为定制固‐固界面而合理设计的嵌合型固相结合肽

摘要

将生物学与材料科学相结合，需要具备在分子水平上设计、工程化和控制生物学与固态材料界面的能力。生物分子之间发生的特定分子相互作用，即分子识别，使生命系统中所有分子过程得以实现，这是生物功能的前提。要想精确设计在固体表面分子定制的生物相容性软界面，必须能够在固体材料与生物组分之间建立特定的生物相互作用。相较于传统化学方法通常依赖共价键进行表面分子附着且灵活性有限，固相结合肽为表面生物功能化提供了极佳的机会。固相结合肽通过基因型与表型关系的定向进化技术筛选获得，因此也被称为用于无机物的基因工程肽（GEPI），其通过分子识别专一性地结合到固体材料上。在此过程中，肽在生物分子与固态晶格之间的多个接触点形成弱相互作用，并通过表面自组织折叠成与底层固态晶格一致的构象。固相结合肽作为模块化构建单元，在生物‐固体界面耦合生物实体与合成实体方面展现出前所未有的生物学优势。充分利用生物学的多样性，这些肽可被轻易工程化，形成具有内在多功能性的嵌合分子，展示出诸如酶、辅因子、抗菌肽、抗体、核酸和靶向生物标志物的分子探针等生物功能分子实体。本小型综述通过一系列实例，深入探讨了固相结合肽的关键原理，这些实例展示了从酶促生物催化到抗菌涂层等多种应用中，在固体表面通过连接、展示和组装功能分子基团所构建的嵌合功能。模块化多功能肽的设计能够调控具有耦合生物功能的分子过程，在生物技术、纳米技术和医学等领域具有广泛的应用前景。

关键词
生物纳米传感器、生物反应器、酶固定化、用于无机物的基因工程肽、GEPI、石墨烯场效应晶体管、模块化肽设计、自组装肽涂层、软生物‐纳米界面、固相结合肽

1 | 引言

生物分子与固体材料的功能整合（Ball, 2001；Fratzl & Weinkamer, 2007；Lowenstam & Weiner, 1989；Sarikaya, Tamerler, Jen, Schulten, & Baneyx, 2003；Seeman & Belcher, 2002）对于制造高效的医疗设备至关重要，这些设备涵盖从诊断到治疗学以及众多其他实际的生物技术和生物传感应用（Hammond, Formisano, Estrela, Carrara, & Tkac, 2016；Nair & Alam, 2006；Sepúlveda, Angelomé, Lechuga, & Liz‐Marzán, 2009年）。制造此类器件的关键在于开发一种有效的分子工具，以调控生物‐固体界面的表面相互作用，从而控制无机材料行为以及固体表面上的生物分子事件（Hammond 等，2016；刘和余，2016；穆古鲁马，Iwasa，Hidaka，Hiratsuka，& Uzawa，2017；Nair & Alam, 2006；萨里卡亚 等，2003；Seeman & Belcher, 2002； Sepúlveda 等，2009）。在尝试制造包含无机固体和生物组分的混合器件时，一个尚未解决的限制是缺乏可编程表面工具，这类工具能够在分子水平上对固体界面处的物质实现精确控制，从而设计出具有可预测行为的稳定生物器件（Bollella & Gorton, 2018； DiBattista, Liotta, & Whitesides, 1996；Karyakin, Presnova, Rubtsova, & Egorov, 2000；穆古鲁马等，2017）。因此，理想的制造策略应是一种环境友好的、生物相容性方法，能够广泛适用于包括蛋白质、肽、脱氧核糖核酸、核糖核酸、肽核酸（PNA）及其他小分子生物分子在内的多种生物活性分子（哈塔耶维奇 等，2010； Mach 等，2019；Moehlenbrock & Minteer, 2011；萨里卡亚 等， 2003；Tadimety 等，2019；塔梅尔勒尔 等，2010；塔梅勒尔 和 萨里卡亚，2008）。

传统沉积方法被开发用于制备包含朗缪尔‐布洛杰特膜、基于多种聚合物材料的多层沉积以及自组装单分子层（SAMs）的多层薄膜和分子器件（Hnilova, Yucesoy, Sarikaya, & Tamerler, 2013； Scholl & Caseli, 2015；Whitesides, 1996）。尽管这些方法已被证明在制备各种多层薄膜和纳米器件方面具有实用性，但它们存在显著缺点，例如在支撑表面上对生物分子的空间定位和取向控制能力有限或缺乏，且工艺复杂、堆叠时间长、成本高（Hnilova 等，2013；萨里卡亚 等，2003）。此外，所需的溶剂和苛刻的加工条件通常与生物分子不兼容，限制了其在生物技术领域，特别是生物医学领域的许多实际应用（Deng, Mrksich, & Whitesides, 1996；King & Lai, 2013；Rusmini, Zhong, & Feijen, 2007；Sajfutdinow 等，2017； Sassolas, Blum, & Leca‐Bouvier, 2012；塔梅尔勒尔 等，2010）。

到目前为止，共价结合和物理吸附一直是将生物分子（例如蛋白质）固定在无机材料表面的主要方法。（鲁斯米尼等，2007）。然而，这两种方法中，由于受限于支撑表面上的取向控制，生物分子呈现出随机取向。通过活化的自组装单层对蛋白质的化学反应性进行控制，或在裸露固体表面上避免复杂的非受控静电相互作用行为（Bhakta、Evans、 Benavidez 和 Garcia，2015；Firestone、Shank、Sligar 和 Bohn，1996；Garcia‐Galan、Berenguer‐Murcia、 Fernandez‐Lafuente 和 Rodrigues，2011；Ramachandran 等， 2004；Sassolas 等，2012；Tack、Schickle、Böke 和 Fischer， 2015）。化学表面修饰和/或交联反应通常会改变生物分子的构象，导致功能性生物分子因非特异性结合而失去功能或稳定性降低。因此，长期以来人们已经认识到，高效构建先进的生物分子器件和系统仍需 要更稳健的偶联技术，并引入材料特异性、模块化且可在支撑表面上实现对预设结构架构进行调控的多功能生物友好型连接子（ Hnilova 等，2013；哈塔耶维奇 等，2010；Ramachandran 等， 2004；萨里卡亚 等，2003；塔梅尔勒尔 等，2010）。

一种理想的表面偶联方法在将分子探针和其他生物活性实体（如酶、抗体及其他功能蛋白）固定到固态器件表面时，应确保具备至少两种功能：首先，固定化方法应对所选的固体表面具有特异性的定制化粘附；其次，在作为生物分子与固体之间的桥梁时，它应具有柔性，以展示化学或基因结合的探针。经过表面功能化的生物分子随后可物理地发挥其生物学选择性，用于靶向或酶功能。满足这些要求的关键是使用一种能与底层固体结构发生类似分子识别的分子相互作用的生物分子实体，这种相互作用是生物分子之间发生的基本相互作用，例如肽‐蛋白、辅因子‐酶或蛋白‐DNA相互作用。

克服传统方法诸多局限性的更优的替代策略，因此可以是利用对无机固体表面具有特异性结合亲和力的肽（Brown，1997；Naik、 Brott、Clarson 和 Stone，2002；萨里卡亚 等，2003；Whaley、 English、Hu、Barbara 和 Belcher，2000）。固相结合肽（SBP），也被称为用于无机物的基因工程肽（GEPI），可实现自固定化，具有生物化学上多功能、可基因定制的特点，并能有效展示生物功能。与使用共价固相表面结合的传统方法不同（Karyakin 等，2000；鲁斯米尼等，2007），GEPI‐表面结合通过包括范德华力、氢键和库仑作用在内的多种弱相互作用共同作用，由于肽在表面上通过多个接触点的构象匹配，从而产生高亲和力（Corni，Hnilova、Tamerler 和 萨里卡亚，2013；Hnilova等人，2008）。因此，这些短序列（7–14个氨基酸）具有强结合能力（knM–M），表现出丰富的化学多样性和高度材料特异性（Corni等人，2013；Hnilova等人， 2008；苏 等，2012）。GEPIs特别适用于医学和生物学领域的应用，因为它们在生物条件下生成并发挥作用，迄今为止尚未显示出任何在细胞培养研究中的毒性（迪巴蒂斯塔 等，1996；多甘 等，2018； 萨里卡亚 等，2003；亚齐奇 等，2016；尤塞索伊、赫尼洛娃 等， 2015）。

GEPIs作为分子工具集的多功能性源于其形成模块化结构的能力，以及可通过简单的点突变、结构域突变和基于残基的生化修饰加以利用的生化与功能多样性，从而提供了控制结合强度、化学特性和生物功能展示的独特机会（图1）（奈克、斯特林格、阿加瓦尔、琼斯 和 石头，2002；苏 等，2012；威斯德姆 等，2016）。嵌合分子的成功设计需要保留整合到最终分子结构中的每个结构域的功能。在基于肽的设计中，可通过使用短的连接肽氨基酸序列实现结构整合，该序列可在肽合成过程中通过基因或化学方法插入GEPI与其融合伙伴之间。连接子序列可以设计为柔性，例如通过重复使用甘氨酸（G），或采用脯氨酸（P）形成刚性结构，或组合其他氨基酸（塔梅尔勒尔 等， 2010；塔梅勒尔 和 萨里卡亚，2009）。通过使用不同数量的G或P重复序列，可定制探针与固体表面之间的物理间距，并借助计算建模实现纳米级精度的定制（塔梅尔勒尔 等，2010；塔梅勒尔 和 萨里卡亚， 2008；威斯德姆 等，2016）。

上述固相结合肽技术的原理为生物制造各种具有可控表面结构和构型的生物‐纳米器件提供了新的生物学途径。在本综述中，我们总结了固相结合肽作为一种生物友好型模块化技术，在固相界面设计可编程功能方面的应用，这些功能可作为生物/纳米杂化器件的重要组成部分，用于集成层次组装的生物活性分子，实现生物传感、分子器件以及功能涂层/薄膜。本文通过纳米技术、生物技术和医学领域中广泛应用的一系列示例，展示了GEPIs（通用工程蛋白界面）的多功能性、可调性和适用性。

2 | 具有固体亲和力和特异性的短肽——一般物理和化学特性

作者的实验室及其他研究团队已通过使用噬菌体和/或细胞表面展示文库进行生物组合诱变，鉴定出大量针对不同材料的特异性肽，例如金属、陶瓷和矿物，如 Au、Ag、Pt、ZnO、TiO2和石墨（Cetinel 等人，2012；Hnilova 等人，2008；奈克、斯特林格 等，2002；塞德拉克 等，2012；Yazici 等, 2013；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015）。许多研究团队已探讨了这些肽在固体表面软界面上的结合与自组装特性的机制（Corni等人，2013；Hnilova等人，2008；苏 等，2012； 周、施瓦茨 和 巴内克斯，2010）。固相结合肽已被证明可作为锚定分子吸附于不同材料表面，从而在多尺度上实现蛋白质与无机载体之间的功能整合。过去二十年中，作者率先将这些无机物结合肽作为分子构建模块，与蛋白质、肽和寡核苷酸等融合伴侣结合，构建用于定向组装应用的多功能单元。这些固相结合肽通常包含7–14个氨基酸序列，因此具有较低的分子量（,000 道尔顿），其等电点可调，在表面折叠时的平均尺寸为1 nm直径（萨里卡亚 等，2003；塔梅尔勒尔 等， 2010；威斯德姆 等，2016）。由于固有筛选程序的作用，这些肽在溶液中通常不会相互作用。当它们结合到固体表面后，可在表面扩散，并通过模板作用与其他肽发生分子间相互作用，进而实现长程有序自组织以达到完全表面覆盖。这些特性使固相结合肽成为表面功能化中高度通用的分子构建模块。

3 | 生物/纳米界面的模块化设计

本文通过三个案例研究，展示了模块化多功能分子结构在表面生物钝化与生物传感应用、多酶固定化以及抗菌分子涂层中的设计与应用。所有示例中，多功能分子构建体均通过固相结合肽在固体表面实现自组装（早水 等 (2016)；哈塔耶维奇 等，2010；Khatayevich 等， 2014；亚齐奇 等，2016；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015）。

3.1 | 生物纳米传感器用分子探针的表面钝化与功能展示

分子生物标志物（如小分子生物分子、蛋白质、寡核苷酸或微生物）的直接检测对于多种疾病的诊断和监测至关重要，这些疾病包括多种癌症、创伤和神经退行性疾病。这些生物标志物可通过患者的血液、组织、唾液或尿液等样本进行检测（瓦伊索切罗娃 等，2008）。传统上，在临床环境中通过免疫分析和电化学检测方法来检测此类生物标志物。这些检测中的靶标检测通常采用多种光谱技术，如比色检测、表面等离子体共振光谱（SPR）和石英晶体微天平（QCM）。然而，许多此类技术信噪比较低，限制了其在临床实践中的应用（周、许、黄 和 陈，2002；迪纳塔莱 等，2003；刘 等，2008；余 等，2006）。由于这些技术灵敏度和特异性较低，难以在复杂环境中检测目标标志物，因而其实用性仍然受限。通常情况下，这些生物标志物在血清、唾液、尿液或组织蛋白质的高丰度背景中浓度较低，导致传感器所需的选择效率难以实现（刘 等，2007；马尼、奇卡维里亚、帕特尔、古特金德 和 拉斯林，2009）。

在过去的几年中，基于二维单层材料的场效应晶体管传感器（ 2D‐FET）因对石墨烯的高度关注而兴起，已被用于显著增强对目标分子的灵敏检测（阿拉姆、王、郭、李 和 曾，2005；库雷利 等， 2008；大野、前桥 和 松本，2010；斯坦、罗宾逊、希恩 和 玉那波， 2010）。与许多其他传统材料（例如金基底）相比，基于二维材料的生物传感器通过超越检测阈值的设计展现出更优越的灵敏度，据报道可检测到飞克/毫升浓度级别的分析物（Alam 等，2005；Ohno 等， 2010；Stine 等，2010）。实现这种灵敏度水平得益于石墨烯优异的电子特性，这些特性源于离域的 π‐键结构和零带隙，使其对分子掺杂和表面结合事件高度敏感（巴拉丁 等，2008；卡斯特罗·内托、几内亚、佩雷斯、诺沃肖洛夫 和 盖姆，2009；诺沃肖洛夫 等，2004；佩奇、早水，So 和 Sarikaya，2012）。特别是，分子与石墨烯基底相互作用引起的电荷转移会改变其狄拉克点，从而改变其作为输出信号的电阻，使得能够在分子水平上特异性检测表面结合事件（Castro Neto 等， 2009；Page 等，2012）。然而，尽管灵敏度非常高，传感器的特异性却受到所用表面功能化技术的显著限制。实现靶标特异性生物探针的稳定固定和/或功能化将极大地受益于可作为实现传感器表面可控相互作用促进剂的分子工具。为了克服这一限制，已开发出多种石墨烯/石墨表面功能化方法（Alwarappan、Erdem、Liu 和 Li，2009； Besteman、Lee、Wiertz、Heering 和 Dekker，2003； Ratinac、Yang、Gooding、Thordarson 和 Braet，2011）。这些方法主要涉及共价键合，例如via引入羧基，但这会因在六方晶格上通过共价相互作用形成表面缺陷而显著改变石墨烯的电子特性，如电子迁移率。为了保持石墨烯的本征性质，已采用基于π − π堆叠芳香化学的非共价功能化方法，但这种方法在传感器表面上缺乏空间结构控制，并且进一步与探针部分进行功能化的容量有限（Hayamizu 等，(2016)；Khatayevich 等，2014）。

固相结合肽已被证明是控制石墨类材料表面性质以及在基底表面上以高度可控的空间排列展示共轭活性生物分子的一种仿生替代方法。针对二维材料（包括石墨（GrBP）和MoS2（MoSBPs））的肽已通过组合肽库筛选获得，并利用理性设计和计算设计原则进一步优化，实现了强结合亲和力（kd = 50 nM–1 μM）和材料特异性（ Hayamizu 等，(2016)；Khatayevich 等，2014；苏 等，2012）。其中，十二肽 WT‐GrBP5（氨基酸序列：IMVTESSDYSSY，亲和常数：Ka = 3.78 μM −1）在结合石墨烯/石墨基底后，会形成长程有序且自组织的纳米结构，以单分子厚层均匀覆盖表面，厚度为~1 nm，其晶体学结构与底层石墨烯晶格匹配（Hayamizu 等，(2016)；苏 等， 2012；Jorgenson、Yucesoy、Sarikaya 和 Overney，2019）（图 2）。当结合到表面时，WT‐GrBP5 肽的序列结构域具有结构模块性，可通过暴露面向分析物的特定氨基酸来实现可预测的表面化学，从而使其非常适合以可控方式呈现分子探针、配体、抗体及其他传感分子 （图1）。

在此，我们展示了利用由WT‐GrBP5（Khatayevich 等，2014）功能化的石墨烯传感器，在血清蛋白背景下选择性检测链霉亲和素（一种模型蛋白）的方法。为此，设计了两种特定的石墨结合肽：第一种用于结合并展示探针分子生物素，命名为bio‐GrBPT5；第二种SS‐GrBP5 与第一种肽共组装，用于防止表面污染。由于这两种肽在自组装表面层中于表面上完全混溶，生物‐GrBP5 可检测目标蛋白质链霉亲和素（SA），而第二种肽则使表面钝化，从而防止非特异性蛋白质吸附到器件表面，确保对目标的特异性选择（图2c,d）。通过在表面上使用两种模块化肽的混合物，已能够在含有大量背景生物分子的牛血清白蛋白背景下检测 SA，灵敏度低于 50 ng/ml（ Khatayevich 等，2014）。

在后续研究中，基于肽的gFET生物传感器旨在检测癌症特异性生物标志物，以促进癌症的早期诊断。在临床环境中检测癌症生物标志物时，例如胰腺癌，要求在血清复杂蛋白质混合物背景下，对癌胚抗原（CEA）和糖类抗原（CA19‐9）等生物标志物的检测水平低于 ng/ml浓度。采用相同方法，可能通过具有更高电子稳定性的四探针 gFET实现对这些低浓度目标物的检测。在此情况下，同样可以使用两种模块化肽，二者均包含相同的结合基团GrBP5，其中第一种与 SS偶联，用于表面钝化；第二种与抗体结合肽偶联，用于靶向特定的生物标志物。如所展示的，可以设想，通过具备两种功能并执行三项任务的适当固相结合肽，可构建适用于多种基于电子、光子和磁性生物传感器的多功能分子构建体：将探针结合到传感器表面；有效地将其展示于分析物中；并在传感器表面形成钝化层，以防止非特异性相互作用并提高信噪比。

3.2 | 利用固相结合肽实现酶的定向固定

生物系统中执行多步生化反应的酶促通路是实现生命的重要功能（孔拉多、瓦尔纳和德丽莎，2008；古特尔等，2012；绍费伦和赫斯特，2012）。借鉴生物学的启示（萨里卡亚 等，2003），在受限环境中仿生重建这些生化反应，在精细化学品（如药品、生物燃料和消费品）的可持续绿色合成以及高效生物分子器件的开发方面具有巨大潜力 （里瓦，2006；威勒，2002）。一个关键限制是在酶靠近固体表面时，维持理想的生物分子取向，从而优化其催化活性。传统策略，包括物理吸附、化学偶联、交联、包埋或封装，往往导致蛋白质随机固定化，常常因活性位点被阻断或活性功能基团发生非预期反应，造成活性降低或丧失（刘和余，2016；穆古鲁马等，2017；鲁斯米尼等，2007）。鉴于自然界中存在大量具有不同功能和由其序列决定折叠模式的蛋白质，迫切需要一种稳健策略来控制生物分子在固相界面上固定时的理想物理取向。在生物纳米技术应用中，一种可靠的固定化方法应具备以下特点：（a）能够将酶或功能蛋白在期望的距离内进行空间定位；（b）控制结构各向异性生物分子在固体表面上的取向和展示；（c）通过最小化固定化引起的催化活性损失，增强对天然功能的催化活性；（d）在生物‐纳米材料界面提供可调性。

在从纳米米到数十微米的多种尺寸尺度上均具有应用潜力（切蒂内尔 等，2013；塔梅尔勒尔 等，2010；尤塞索伊、卡拉卡 等，2015）。此外，可持续绿色合成方法若能整合涉及多种酶的多步生化反应，将大受裨益；然而，其成功取决于固定化方法，这些方法能够通过调控酶对之间的理想距离以实现顺序功能，从而克服扩散限制（马尼 等， 2009）。

用作酶融合伴侣的固相结合肽有望克服涉及生物分子的固定化难题。所得到的多功能分子构建体可在生物‐纳米界面处实现酶在特定距离内和理想取向下的定向自固定化，并能够在固体表面上保持较高的生物化学活性。我们先前的研究已证明，可将无机物结合肽作为特异性融合标签伴侣，用于在不同层级构型的金、银和二氧化硅等多种无机表面上固定功能蛋白，包括麦芽糖结合蛋白（赫尼洛娃、卡拉卡 等， 2012）、绿色荧光蛋白（赫尼洛娃、刘 等，2012）、碱性磷酸酶（卡尔 等，2009）、乳酸脱氢酶（切蒂内尔 等，2013）以及甲酸脱氢酶（尤塞索伊、卡拉卡 等，2015）。本文所展示的实例涉及一个包含两种不同酶的酶系统，这两种酶以期望的取向彼此空间邻近地固定。所选的酶组合被设计用于执行依赖于两者之间时间活性的级联反应。

将受限的金结合肽（cAuBP2）通过基因工程与嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）乳酸脱氢酶（LDH）（切蒂内尔 等，2013）和甲基酵母（Candida methylica）甲酸脱氢酶（FDH） （尤塞索伊、卡拉卡 等，2015）进行融合。所选的酶组合LDH和 FDH是研究级联反应的两种特征明确的模型酶。在此模型中，LDH 催化丙酮酸生成手性乳酸，同时氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；FDH则将甲酸分解为二氧化碳，同时将NAD+还原为NADH（卡拉居勒、西申斯、比奈、奥尔杜和克拉克，2007；里瓦，2006）。当这两种酶联合使用时，可作为合适的研究模型，用于乳酸生产过程中相对昂贵的辅因子NADH再生的级联反应研究。

两种融合酶均设计在其N端带有组氨酸标签，以简化纯化过程 （图3）。在组氨酸标签和LDH及FDH的N端之间插入了一段长度为 18个氨基酸、结构受限且通过生物组合方法筛选出的金结合肽序列 （cAuBP2）（Corni等人，2013年；Hnilova等人，2008年）。为了防止组氨酸标签与金表面发生非特异性相互作用，在cAuBP2区域旁边插入了特异性蛋白酶识别序列，以便在纯化过程后通过特异性蛋白酶去除组氨酸标签。在两种融合酶中，肽标签与酶之间均整合了一段结构上柔性的<1 nm长的间隔序列GGGS（甘氨酸‐甘氨酸‐甘氨酸‐ 丝氨酸），作为工程连接子，以确保肽标签能够自由暴露于环境中而不受任何阻碍通过任一酶的分子间相互作用（图3b）。接下来，通过在340纳米处分光光度法测定NADH的生成/消耗，定量分析了每种融合酶的催化活性。据报道，cAuBP2‐LDH和cAuBP2‐FDH的催化转换速率分别为66.8 ± 3.7 s−1 和0.61 ± 0.02 s−1 ，与野生型LDH（78.5 ± 4.5 s−1） 和FDH（0.59 ± 0.02 s−1）相比，在插入肽标签后催化活性未出现显著降低。另一方面，cAuBP2‐LDH和cAuBP2‐FDH对金表面的分子亲和力分别提高了~8倍和~12倍，相较于野生型酶。随后，我们利用氧化铝（AAO）整体膜制备的流动生物反应器，展示了 AuBP2‐LDH和 ‐FDH酶的顺序固定化。陶瓷膜上高度取向的纳米通道可用于模拟生物级联反应。

基因整合的肽标签的存在促进了融合酶在金和Ni‐NTA功能化表面上以空间定义的级联几何结构进行自组织。在室温下连续操作10天期间，超过80%的NADH再生保持稳定，并在10天内逐渐下降~15%。作为模块化结构域与酶融合的金结合肽所提供的固定化能力，相较于传统固定化酶反应器具有前所未有的优势。如本文所示，固相结合肽可作为构建涉及复杂结构和生化环境中级联生物过程的化学和生化反应的关键分子设计组件。

模块化肽实现的酶固定化策略及用于级联生产的酶的空间定向组装的概念示意图)
基于固相结合肽的抗菌植入物涂层的概念示意图)

3.3 | 生物功能涂层/工程化保护性分子生物膜

植入物是医学中常见的治疗手段，用于替代缺失的组织和器官；它们也可作为支撑材料以增强受损的生物结构（Geetha, Singh, Asokamani, & Gogia, 2009；Khatayevich 等，2010；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015；Zhang & Webster, 2009）。理想的医用植入物应具备与自体组织相当的生物力学和结构特性，且不会引起不良反应。多种材料，例如钛、氧化锆和不锈钢，具有理想的物理和机械性能，已被用作植入物。然而，由于合成材料与生物组织在内在结构和功能上存在差异，在控制组织/植入物界面处的生物反应方面仍存在局限性，这会影响植入材料的使用寿命（Geetha 等，2009； Guillaume, 2016；Pye, Lockhart, Dawson, Murray, & Smith, 2009；Subramani, Jung, Molenberg, & Hammerle, 2009）。为了提高植入治疗的成功率，应根据植入部位和植入类型，针对预期用途对材料进行精细设计，以实现所需的性能和耐久性（Yazici 等, 2013）。例如，牙科和骨科植入物通常需要具备生物活性，以增强组织相容性以及抗感染性以防止口腔环境中的细菌侵入和定植。另一方面，用于静脉内植入物的材料，例如支架和起搏器电极，需要具备生物惰性，以限制与循环环境发生不良相互作用，从而抵抗表面污染（纳拉亚纳 和 斯里哈里，2019）。提高植入物生物相容性和耐久性的常用策略是用共价连接分子修饰其表面。根据预期用途，这些分子可以是聚乙二醇（PEG）（防污）、调控粗糙度（细胞相容性）以及陶瓷涂层（骨整合）（哈塔耶维奇 等，2010）。尽管这些方法在一定程度上能够解决与生物相容性相关的问题，生物功能性和生物耐久性，然而，许多传统的表面功能化方法要么仅限于有限范围的材料，要么需要在材料表面上存在特定的官能团以进行复杂的化学偶联过程，因此这些方法均无法提供永久性的解决方案。

在过去的十年中，固相结合肽作为多功能分子工具的实用性已得到证实，可用于多种生物医学表面的生物功能化，包括通过聚乙二醇偶联的金结合肽（GBP）开发防污金表面（哈塔耶维奇 等，2010），以及利用与RGD基序融合的钛结合肽（TiBP）构建具有增强生物相容性的工程化钛表面（亚齐奇 等，2013）以及利用与抗菌肽融合的材料特异性固相结合肽构建的抗感染植入表面（钛和氧化锆）（亚齐奇 等，2016；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015）。

下一个示例描述了基于肽的抗菌植入物涂层的开发，以预防与植入物相关的感染，这类感染会严重影响植入设备的使用寿命，并是导致植入失败的主要原因（亚齐奇 等，2016；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015）。为此，构建了一种新型嵌合肽，包含固相结合肽和抗菌肽（GEPI‐AMP）。抗菌肽（AMPs）是一类新型细菌治疗剂，具有刺激先天免疫反应的能力，且不易引起细菌耐药性。该工程化嵌合结构同时具备两种功能：其中一个结构域通过固相结合结构域结合到植入物表面，而另一个结构域则展示出抗菌特性（图4a）。植入材料可以是金属类，例如钛基合金，或氧化物类，如氧化锆基陶瓷，因此分别需要使用针对Ti或ZrO2的结合肽。

在本示例中，钛植入表面涂覆有TiBPS1‐AMP1嵌合肽，该嵌合肽包含相应的固体结合单元——钛结合肽以及抗菌肽单元AMP1。该生物功能单元在溶液中和吸附于固体表面两种状态下，均通过实验检测了其功效。实验在体外条件下进行，针对三种常见的人类宿主致病菌：Streptococcus mutans、Staphylococcus epidermidis 和 Escherichia coli（亚齐奇 等，2016；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015）。溶液中的活性测试表明，AMP单元与固体结合肽结合后，其抗菌活性得以保留（亚齐奇 等，2016；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015）。该植入物表面涂覆嵌合肽（TiBPS1‐AMP1）后，与裸植入物相比，对三种细菌物质均表现出显著的抗性（亚齐奇 等，2016；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015）。另一方面，单独使用抗菌肽作为涂层材料在抑制细菌黏附与生长方面效果不足。这很可能是因为肽与表面之间的相互作用具有非特异性和弱相互作用特性，表明需要一种分子连接子，以实现抗菌肽在植入物表面上的有效展示（图4a‐d）。

总体而言，基于工程化嵌合肽的抗菌植入物涂层方法在开发无感染植入物方面具有诸多优势。首先，与传统的、繁琐的多步表面处理工艺不同，基于嵌合肽的植入物涂层无需对植入物表面进行任何化学修饰，因此通过避免使用有害化学物质，提供了一种生物友好方式的植入物涂层技术。其次，通过消除多步表面处理过程，该方法可在一步工序中实现此类植入物的快速制备，具备临床椅旁实施的实用性，即在手术室中将植入物简单浸入嵌合溶液进行涂层即可完成操作。第三，利用抗菌肽（AMPs）作为抗菌单元，有望有效应对日益严重的细菌抗生素耐药性问题。最后，固体结合肽的模块化特性使其可针对几乎任何给定的植入材料进行实验分离，这为利用多种理想的AMP融合伴侣开发新型嵌合单元提供了广阔前景。（威斯敦、陈 等，2019； 威斯敦 等，2019；尤塞索伊、赫尼洛娃 等，2015）本研究提出的原则可应用于其他植入材料，未来有望推动更简便治疗模式下无感染植入材料的发展。

4 | 结论

固相结合短肽可对固体的结合、完全覆盖和自体生物功能化实现多功能调控，从而形成明确的表面性质，这对于构建用于多种应用的工程化、化学成分丰富的生物‐固体界面至关重要。通过定向进化方法筛选出的具有固相结合活性的短肽序列，当与固体基底结合时，为定制固相界面提供了前所未有的机遇，形成了新一代的杂化材料系统。通过遗传控制实现连接及其杂化材料功能的方法，有望克服传统合成连接剂（如硫醇或硅烷）在广泛应用中所面临的生物不相容性、不稳定性和非特异性等重大局限。GEPIs的可调特性使其成为一种生物分子工具，可用于在固体表面创建定制软界面，应用于可控酶固定化、开发抗菌分子涂层以及高效连接分子探针用于生物纳米传感器（图5）。例如，通过将GEPI与功能蛋白（如酶或抗体）进行基因融合，可实现多功能性，形成异源功能分子结构，其中肽段可有效将酶固定在固体表面，同时使酶功能域正确展示以发挥功能。目前已有大量可用的偶联策略，可通过肽键、侧链修饰以及N端或C端点击化学等方式，高度灵活地连接具有正交功能的分子实体。肽‐肽超分子骨架相互作用使其成为一种通用工具，可用于多种生物活性分子，包括DNA、 RNA、PNA、糖类、脂质以及其他小分子生物分子（如辅因子），以及肽和蛋白质。首先，GEPIs对特定固体材料具有特异性亲和力，这些材料可以是金属（金、银、铂、钛）、陶瓷（二氧化硅、氧化铝、方解石、羟基磷灰石）或单原子层二维固体（石墨烯/石墨、MoS2, BN），从而形成高度生物功能化的表面。研究表明，基于其特异性亲和力和组装特性，无机物结合肽在杂化结构中已成为整体结构的关键组成部分，不仅提供必要的分子连接，还将功能性（如机械性能）耐久性赋予整个结构。模仿天然蛋白质的功能，固相结合肽的内在特性在材料科学中具有广泛的应用潜力，从颗粒合成与组装（具有遗传控制的物理和化学特性），到分子生物学、生物技术和医学领域中对生物分子靶标的探测，在未来几年将发挥重要作用。