13、数字PCR技术：原理、分区方法及应用优势

数字PCR技术：原理、分区方法及应用优势

1. 数字PCR的误差与优化

数字PCR（dPCR）在新冠病毒筛查、检测等系统中具有重要作用，但也存在一些误差问题。假阳性可通过适当的检测设计和优化来最小化，但假阴性或分子丢失问题则较难处理。dPCR检测的内在设计使其容易出现分子丢失，原因如下：
- 小体积（皮升至纳升范围）分区导致的高表面积与体积比，增加了试剂与表面或界面相互作用而抑制PCR的可能性。
- 单分子扩增通常比多分子扩增效率低。
- 扩增效率高度依赖DNA来源，且DNA分子受热会影响扩增效率。

dPCR的数学框架涵盖了其统计性质和内在不确定性，但实际方差还应考虑DNA提取和预扩增等上游过程的影响。例如，对低目标浓度样本进行预扩增以达到最佳λ值（1.6）可能很有吸引力，但预扩增反应的方差不具有系统性且无法校正，因此直接定量低目标浓度样本仍是更可取的方法。在评估检测准确性时，需要考虑dPCR对分子丢失的敏感性以及样本制备（提取和/或预扩增）的变异性。适当的检测设计和验证对于最小化分子丢失、假阳性或信号阈值设置不当等典型问题至关重要。

2. 数字PCR的小型化与超分区技术

早期dPCR使用微管或384孔微孔板，但这些格式存在分区数量有限、自动化程度低和试剂成本高等问题。微流控技术的发展实现了样本的大规模并行分区，推动了dPCR平台的出现。微流控依赖于从微电子学改编而来的微制造技术，其实现方式包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）软光刻快速原型制作、玻璃蚀刻或注塑成型。许多主动和被动微流控方法已用于样本分区，从物理分区到液滴分区，这些方法大多允许简单的自动化和有限的试剂使用。

在介绍分区方法之前，先提及一些无分区方法