29、蛋白质与核酸：从基础到研究方法的全面解析

fox11

于 2025-10-05 11:49:46 发布

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分类专栏：精准医学引领中风革命文章标签：蛋白质核酸蛋白质纯化

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蛋白质与核酸：从基础到研究方法的全面解析

1. 蛋白质概述

蛋白质是细胞干重的主要贡献者，也是人体中最复杂的大分子。一方面，它们是细胞结构的关键组成部分，提供“细胞骨架”；另一方面，它们是构成生命的复杂生化相互作用的主要元素。蛋白质由mRNA在核糖体中翻译形成各种氨基酸组成的多肽链，随后通过一系列越来越复杂的翻译后修饰，如折叠、共价修饰（如甲基化、乙酰化、磷酸化、脂化和糖基化）、切割和组装成多亚基蛋白，形成具有关键功能的结构。

2. 蛋白质研究方法

2.1 蛋白质纯化

在对特定蛋白质或一组蛋白质进行分析之前，需要从含有数千种其他蛋白质和大分子的细胞匀浆中纯化出目标蛋白质。常见的方法有：
- 离心法 ：包括差速离心和密度梯度离心。差速离心根据颗粒的沉降速率，利用不同水平的离心力分离颗粒；密度梯度离心则在施加离心力后，依据颗粒的大小和质量（速率区带离心）或密度（等密度离心）分离溶液。
- 选择性沉淀 ：通过改变pH/盐平衡或添加沉淀剂（如乙醇、丙酮和聚乙二醇等），利用蛋白质的不同溶解度进行沉淀。
- 免疫沉淀 ：使用抗体沉淀特定的目标蛋白质。

2.2 蛋白质分离

色谱法 ：是一种非常通用的分离不同蛋白质混合物的方法，依赖于固定相和流动相，两者不混合，并根据所选方法确定的不同性质竞争混合物中的成分。常见的色谱法包括：
- 柱色谱 ：将蛋白质混合物置于装有固定相（无机材料、合成有机聚合物或多糖）的垂直柱顶部，流动相根据蛋白质的吸附或分散特性以不同速度使蛋白质沿固定相移动。
- 高效液相色谱（HPLC） ：是标准柱色谱的一种变体，使用更小的基于硅的珠子作为固定相，不锈钢柱能够承受更高压力的流动相通过，显著提高了分离过程的可扩展性和速度。
- 尺寸排阻色谱（凝胶过滤色谱） ：柱中填充多孔珠子，根据蛋白质的分子大小对其进行过滤。较小的蛋白质能够通过孔，移动速度更快，而较大的蛋白质则被迫绕过珠子。
- 离子交换色谱 ：蛋白质根据与固定相的静电相互作用沿固定相移动。带有正电荷基团的固定相（阴离子交换剂）会使带负电荷更多的蛋白质移动更慢，而带有负电荷基团的固定相（阳离子交换剂）则相反。
- 疏水相互作用色谱 ：固定相成分涂有疏水基团，会保留具有相似疏水表面的蛋白质，而非粘附蛋白质则随高离子强度的流动相自由移动。
- 亲和色谱 ：与其他非特异性色谱方法不同，该方法基于固定相（嵌入目标蛋白质的配体）和目标蛋白质之间的选择性特性。常见的相互作用包括抗原与抗体、酶与底物、激素与受体等。
凝胶电泳 ：通过在半透膜凝胶（如聚丙烯酰胺、琼脂糖）中对蛋白质溶液施加电场，根据蛋白质的净电荷在不同电流下分离蛋白质。当蛋白质保持其天然结构时，称为天然凝胶电泳；而在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）中，蛋白质会先经过SDS、2 - 巯基乙醇和加热处理，使其变性并增加负电荷，然后根据分子量在聚丙烯酰胺基质中迁移。蛋白质可以用考马斯亮蓝等染料可视化。
等电聚焦（IEF） ：利用电场根据蛋白质的等电点（pI）分离蛋白质，即当蛋白质的净电荷为零时。通过在聚丙烯酰胺基质中使用离子缓冲液和电场创建pH梯度，使蛋白质迁移到pI为零的点。
二维凝胶电泳（2DGel） ：先进行IEF，再进行SDS - PAGE，能够先根据pI分离分子量非常相似的蛋白质，然后再根据大小分离，对于分析复杂的蛋白质混合物非常有用。

以下是蛋白质分离方法的对比表格：
|分离方法|原理|优点|缺点|
| ---- | ---- | ---- | ---- |
|柱色谱|根据吸附或分散特性分离|操作相对简单|分离效率可能较低|
|高效液相色谱|基于小珠子固定相和高压流动相|速度快、可扩展性高|设备成本高|
|尺寸排阻色谱|根据分子大小过滤|温和，不改变蛋白质性质|分辨率有限|
|离子交换色谱|基于静电相互作用|选择性好|对pH和离子强度敏感|
|疏水相互作用色谱|利用疏水特性|可分离特定疏水蛋白质|需要特定条件|
|亲和色谱|基于选择性相互作用|特异性高|配体制备可能复杂|
|凝胶电泳|根据净电荷和分子量分离|直观、可可视化|样品处理较复杂|
|等电聚焦|根据等电点分离|分辨率高|操作要求严格|
|二维凝胶电泳|结合IEF和SDS - PAGE|分离效果好|过程复杂|

mermaid流程图如下：

graph LR
    A[蛋白质混合物] --> B{分离方法}
    B --> C[柱色谱]
    B --> D[高效液相色谱]
    B --> E[尺寸排阻色谱]
    B --> F[离子交换色谱]
    B --> G[疏水相互作用色谱]
    B --> H[亲和色谱]
    B --> I[凝胶电泳]
    B --> J[等电聚焦]
    B --> K[二维凝胶电泳]

2.3 蛋白质鉴定和定量

质谱法（MS） ：是一种高通量技术，能够检测并在特定设置下定量包括蛋白质在内的各种大分子。其工作流程包括：蛋白质纯化和分离后，将蛋白质消化成较小的肽段并进行分子电离，形成完整离子的气相；然后通过磁场、电场或电磁场在质量分析仪中根据质荷比（m/z）或飞行时间（TOF）分离离子化分子；最后，分离的离子化分子到达检测器，在质谱图中绘制结果，根据质谱图鉴定各种氨基酸并根据信号强度进行定量。常见的基于MS的协议有：
- 液相色谱 - 质谱联用（LC - MS） ：在MS分析之前使用液相色谱分离蛋白质，并通过电喷雾电离使肽段分子电离。
- 基质辅助激光解吸/电离 - 飞行时间质谱（MALDI - TOF） ：使用激光束激发吸收光的液体基质，为预处理的肽段提供质子进行分子电离。
- 串联质谱（MS/MS） ：通过两个或多个连续的MS步骤，先根据质量分离肽段，然后分离目标肽段并进一步解析其质谱。
酶联免疫吸附测定（ELISA） ：结合针对目标蛋白质的抗体和酶，加入底物产生颜色、发光或荧光变化，用分光光度计或荧光计客观评估，根据信号强度定量目标蛋白质。根据实验控制的不同，可以定量抗原或抗体。常见的变体有：
- 直接ELISA ：基于酶联抗体与特定抗原的直接连接。
- 间接ELISA ：基于酶联的二级抗体与连接抗原的一级抗体的连接。
- 夹心ELISA ：涉及三种抗体的连接，是所有ELISA方法中最敏感的形式。
- 竞争ELISA ：基于酶联抗体或酶联抗原与目标抗原 - 抗体相互作用的竞争，酶促反应的信号与研究的蛋白质成反比。
蛋白质印迹法（Western blot） ：常用于蛋白质的相对定量，先进行凝胶电泳，然后通过电流将蛋白质转移到多孔膜上，通过抗体检测特定蛋白质。由于其可扩展性有限，还开发了更高通量的版本，如反向相蛋白质裂解物微阵列（RPA）和微蛋白质印迹阵列（MWA）。

2.4 蛋白质序列和结构

在基于MS的技术出现之前，蛋白质测序通过Edman方法实现，该方法能够从多肽的N端确定其氨基酸组成和顺序。蛋白质不仅仅是氨基酸序列（一级结构），还包括二级结构（α - 螺旋和β - 折叠）、三级结构（多肽链的三维组织）和四级结构（由各种多肽链组成的蛋白质）。可以使用圆二色性（CD）、核磁共振（NMR）光谱、X射线晶体学和电子显微镜（EM）等工具来解析这些蛋白质结构水平。

3. 核酸概述

人体细胞的基因组由约30亿个碱基对（bps）的双链脱氧核糖核酸（DNA）分子组成，紧密包装在46条染色体中。基因转录成单链核糖核酸（RNA），这是一种更不稳定但功能极其多样的大分子，以多种方式控制基因表达。常见的RNA类型包括：
- 信使RNA（mRNA） ：编码RNA，可翻译成蛋白质。
- 核糖体RNA（rRNA） ：核糖体的基本元素，负责蛋白质翻译。
- 转运RNA（tRNA） ：负责连接氨基酸和将RNA翻译成多肽链。
- 小核RNA（snRNA） ：负责mRNA的选择性剪接，产生各种蛋白质异构体。
- 微小RNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA） ：负责在RNA水平上抑制基因表达。

4. 核酸研究方法

4.1 核酸提取

DNA和RNA的提取都涉及用洗涤剂裂解细胞、用蛋白酶消化蛋白质、离心和沉淀。由于DNA的稳定性，使用各种不同的试剂盒提取DNA非常直接；而提取RNA则需要小心处理样品，因为普遍存在的RNase酶会降解RNA。

4.2 核酸可视化和定量

Southern和Northern印迹 ：分别用于可视化DNA和RNA。凝胶电泳根据大小分离片段，然后将凝胶转移到膜或纸上，加入互补标记的探针，通过杂交揭示目标片段的位置。Southern印迹在凝胶电泳前用限制性酶切割DNA并使其变性成单链，可用于基因分型；Northern印迹可用于相对定量基因表达。
定量聚合酶链反应（qPCR） ：基于DNA复制的生物学方法，使用热稳定的DNA聚合酶、引物和游离核苷酸，通过变性、退火和延伸的循环指数复制DNA分子。通过添加与PCR产物相互作用的荧光染料或探针，可以定量体外DNA的产生，从而确定DNA的初始浓度。既可以相对定量（相对于作为基线的基因），也可以绝对定量（通过制作标准曲线），还可以通过分析荧光探针的熔解曲线进行基因分型。
DNA微阵列 ：用于相对定量基因表达或基因分型，在平板上放置大量针对特定基因或单核苷酸多态性（SNP）的探针，加入标记的DNA/cDNA（通常使用荧光染料），通过荧光强度记录与目标序列的杂交情况。通常会对对照和目标样品进行比较，根据荧光模式确定差异表达的基因和不同的SNP数量。全基因组分析研究（GWAS）大多使用DNA微阵列来研究患者和对照以及不同人群之间的SNP差异。

以下是核酸可视化和定量方法的对比表格：
|方法|适用对象|原理|优点|缺点|
| ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
|Southern印迹|DNA|凝胶电泳分离后杂交|可确定DNA片段位置|操作复杂，灵敏度有限|
|Northern印迹|RNA|凝胶电泳分离后杂交|可相对定量基因表达|操作复杂，灵敏度有限|
|qPCR|DNA/RNA（通过cDNA）|基于DNA复制循环和荧光检测|定量准确，可基因分型|需要特定设备和引物设计|
|DNA微阵列|DNA/cDNA|探针杂交和荧光检测|可同时检测多个基因和SNP|成本较高，结果分析复杂|

mermaid流程图如下：

graph LR
    A[核酸样品] --> B{可视化和定量方法}
    B --> C[Southern印迹]
    B --> D[Northern印迹]
    B --> E[qPCR]
    B --> F[DNA微阵列]

4.3 核酸测序

桑格测序 ：使用双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTPs），由于其缺乏3′羟基，会阻止正在复制的DNA链的延伸。PCR扩增后，将DNA分子分成四个管，每个管含有一种ddNTP和其余三种核苷酸以及DNA聚合酶，扩增得到不同大小的片段，通过凝胶电泳重建原始DNA片段序列。该方法后来改进为使用荧光标记的ddNTPs的自动毛细管凝胶电泳。
大规模平行测序（MPS）或下一代测序（NGS） ：与桑格测序完全不同，通过产生大量可生物信息学比对到共识序列的读数进行测序。常见的方法有：
- Illumina测序 ：在微阵列上通过合成测序进行反应，使用带有不同荧光染料标记的核苷酸，类似于桑格测序中的ddNTPs，但标签可以酶促去除，然后添加另一个标记的核苷酸，通过读取不同荧光颜色的序列确定DNA序列。
- 离子 torrent测序 ：在覆盖有DNA的珠子上通过半导体测序进行反应。每个珠子在PCR富集后覆盖相同的DNA片段，当孔中填充特定核苷酸时，电压敏感的半导体芯片检测pH变化，因为核苷酸掺入时会释放质子，根据pH变化确定序列。
纳米孔测序 ：有时被归类为第三代测序技术，能够通过固定的DNA聚合酶对单个DNA分子进行测序，通过测量带有不同可去除荧光染料的核苷酸在聚合酶上停留的时间来确定序列。尽管可以实现长达约10,000 bps的读数，但该方法的错误率显著增加。

NGS技术彻底改变了基因组学领域，使得全基因组和外显子组（仅编码区域）的测序成为可能，并开创了转录组学（RNA - seq）和表观基因组学（甲基化测序）等领域，以及旨在收集多样化全基因组并公开的1000 Genomes Project。随着NGS价格的持续下降，其应用将更加广泛。

蛋白质与核酸：从基础到研究方法的全面解析

5. 蛋白质与核酸研究方法的综合应用与展望

在生物医学研究中，蛋白质和核酸的研究方法往往相互配合、综合应用，以深入了解生物过程、疾病机制，并开发新的诊断和治疗方法。

例如，在研究某种疾病的发病机制时，首先可以通过蛋白质纯化和分离技术，从患者样本中获取与疾病相关的蛋白质。然后，利用蛋白质鉴定和定量方法，确定这些蛋白质的种类和含量变化。同时，通过核酸提取和测序技术，分析患者细胞中的基因序列和表达水平，找出可能与疾病相关的基因突变或基因表达异常。

以癌症研究为例，研究人员可以使用蛋白质印迹法检测肿瘤组织中特定蛋白质的表达水平，判断肿瘤的恶性程度和预后情况。同时，通过下一代测序技术对肿瘤细胞的基因组进行测序，发现潜在的致癌基因突变，为开发个性化的抗癌药物提供靶点。

在药物研发方面，蛋白质和核酸研究方法也发挥着重要作用。通过蛋白质结构解析技术，了解药物靶点的三维结构，有助于设计出更具针对性的药物分子。而核酸技术则可以用于筛选和验证药物的疗效和安全性，例如通过RNA干扰技术抑制特定基因的表达，观察药物对细胞生理功能的影响。

未来，随着技术的不断发展，蛋白质和核酸研究方法将不断创新和完善。例如，质谱技术的灵敏度和分辨率将进一步提高，能够检测到更微量的蛋白质和核酸。纳米孔测序技术的错误率有望降低，实现更准确、更快速的长读长测序。此外，人工智能和机器学习技术的应用，将有助于更高效地分析和解读大量的蛋白质和核酸数据，加速生物医学研究的进展。

以下是蛋白质与核酸研究方法综合应用的示例表格：
|研究领域|蛋白质研究方法|核酸研究方法|综合应用目的|
| ---- | ---- | ---- | ---- |
|疾病诊断|蛋白质印迹法、ELISA|qPCR、DNA微阵列|确定疾病标志物，辅助诊断|
|疾病机制研究|蛋白质组学、质谱法|全基因组测序、转录组学|找出疾病相关的蛋白质和基因变化|
|药物研发|蛋白质结构解析、亲和色谱|RNA干扰、基因编辑|设计药物靶点，验证药物疗效|

mermaid流程图展示蛋白质与核酸研究方法在疾病研究中的综合应用：

graph LR
    A[患者样本] --> B{蛋白质研究}
    A --> C{核酸研究}
    B --> B1[蛋白质纯化]
    B --> B2[蛋白质分离]
    B --> B3[蛋白质鉴定和定量]
    C --> C1[核酸提取]
    C --> C2[核酸测序]
    C --> C3[核酸可视化和定量]
    B3 --> D[确定蛋白质变化]
    C3 --> D
    D --> E[分析疾病机制]
    E --> F[开发诊断方法]
    E --> G[设计治疗策略]

6. 实际案例分析

为了更好地理解蛋白质和核酸研究方法的实际应用，下面以中风研究为例进行详细分析。

6.1 中风相关蛋白质标志物

中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）可作为炎症的临床标志物，与多种心血管疾病（包括中风）的风险增加有关，还可用于评估缺血性中风出血转化的风险。目前，大多数白细胞计数采用自动化技术，如流式细胞术和细胞化学。

B型利钠肽（BNP）和N末端前BNP（NT - proBNP）与缺血性中风（尤其是心源性栓塞性中风）的风险增加有关，对中风患者的功能预后和死亡率也有预测作用。最初，BNP是通过沉淀、色谱和Edman方法鉴定的，现在则采用各种免疫测定技术。

6.2 中风相关核酸标志物

信使RNA（mRNA）在中风研究中也具有重要意义。一些特定的mRNA可能与中风的发生、发展和预后相关。通过核酸提取和测序技术，可以分析这些mRNA的表达水平变化，为中风的诊断和治疗提供新的靶点。

例如，通过对中风患者和健康对照的血液样本进行RNA测序，发现某些mRNA的表达水平在中风患者中显著改变。这些mRNA可能参与了炎症反应、神经保护等生物过程，有望成为中风诊断和治疗的生物标志物。

以下是中风相关标志物研究的总结表格：
|标志物类型|具体标志物|检测方法|临床意义|
| ---- | ---- | ---- | ---- |
|蛋白质|NLR|流式细胞术、细胞化学|评估中风风险和出血转化风险|
|蛋白质|BNP、NT - proBNP|免疫测定技术|预测中风风险和预后|
|核酸|特定mRNA|RNA测序|寻找中风诊断和治疗靶点|

mermaid流程图展示中风相关标志物研究的流程：

graph LR
    A[中风患者和健康对照样本] --> B{样本处理}
    B --> B1[蛋白质提取和检测]
    B --> B2[核酸提取和检测]
    B1 --> C1[确定蛋白质标志物]
    B2 --> C2[确定核酸标志物]
    C1 --> D[分析标志物与中风的关系]
    C2 --> D
    D --> E[开发中风诊断和治疗方法]

7. 总结

蛋白质和核酸是生命活动的重要分子基础，对它们的研究对于理解生物过程、疾病机制以及开发新的诊断和治疗方法至关重要。蛋白质研究方法包括纯化、分离、鉴定、定量、测序和结构解析等，而核酸研究方法涵盖提取、可视化、定量和测序等。这些方法相互配合，在生物医学研究中发挥着不可或缺的作用。

随着技术的不断进步，蛋白质和核酸研究方法将不断完善和创新，为生物医学领域带来更多的突破和发展。在实际应用中，通过综合运用这些方法，可以深入了解疾病的发生机制，发现新的生物标志物，为个性化医疗和精准医学的发展提供有力支持。同时，实际案例分析也表明，这些研究方法在中风等疾病的研究中具有重要的应用价值，有望为改善患者的健康状况做出贡献。

在未来的研究中，我们可以期待这些技术的进一步融合和发展，以及在更多疾病领域的广泛应用，为人类健康事业带来更多的福祉。