43、AAV 载体生产全流程指南

AAV 载体生产全流程指南

1. 前期准备

在进行 AAV 载体生产前，需要对质粒 DNA 进行扩增和表征。这是整个流程的基础步骤，能够确保后续转染实验的顺利进行。

2. PEI 介导的 HEK 293T 细胞分割转染

PEI 介导的细胞系转染是一种经济高效的生产 AAV 载体的方法。与常见的前一天准备 HEK 293T 细胞进行转染相比，这种分割转染方法在细胞准备方面更加灵活，并且能在单位面积上准备更多的细胞（转染时细胞汇合度可达 90% - 95%，而前一天准备的细胞汇合度为 70% - 80%）。

2.1 质粒 DNA 和 PEI 溶液的制备

对于单个 AAV 载体的制备（基于五个 15 cm 细胞培养板），制备质粒 DNA 和 PEI 溶液大约需要 60 分钟。若同时制备多个 AAV 载体，每个载体的制备时间会显著减少（十个 AAV 载体制备大约需要 3 - 4 小时）。具体操作步骤如下：
1. 为五个 15 - cm 细胞培养板准备两个 50 ml 反应管，并在两个管子上都标注要生产的 AAV 载体名称。
2. 另外，在其中一个 50 ml 反应管上标注“PEI”。
3. 计算需要加入到 50 ml 反应管中的无菌超纯水、5 M NaCl 溶液、质粒 DNA 和 PEI 溶液的体积。
4. 在生物安全柜 II 级中，向每个 50 ml 反应管中加入计算好体积的无菌超纯水。
5. 向每个 50 ml 反应管中加入 450 μl 5 M NaCl 溶液。
6. 将质粒 DNA 加入标注有 AAV 载体名称的管子中。
7. 将 PEI 溶液加入标注有“PEI”