混合纳米显微镜在电-生物-化学研究中的应用

第34章 集成混合纳米显微镜的电‐生物‐化学研究

莱克什米·凯拉斯1,∗和赛义德·A·M·托法尔
1,21Bernal Institute, University of Limerick, Ireland
2Department of Physics and Energy, University of Limerick, Ireland
∗Corresponding author: lekshmi.kailas@ul.ie

由于其截然相反的性质，对“软”材料（如生物物种）和相对较硬的材料（如金属或聚合物医疗设备）进行同步纳米尺度成像十分困难。如果同时需要化学和电学信息，这一困难将更加突出。通过结合扫描探针显微镜的电学模式、共聚焦激光扫描显微镜和拉曼光谱的混合纳米显微镜，可以应对这一挑战。

1. 引言

为了更好地理解表面特性，并对表面特性进行适当的调整以适应实际应用，充分表征材料和表面的物理、化学、机械、热学和电学性质至关重要。目前，用于在纳米尺度上研究这些性质的表征技术种类繁多，数量众多。

原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）和光学显微镜等技术被广泛用于观察表面形貌。表面的元素组成和表面化学状态可以通过二次离子质谱（SIMS）、X射线光电子能谱（XPS）、俄歇电子能谱（AES）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱等分析技术获得。X射线衍射（XRD）、透射电子显微镜（TEM）等则提供有关晶体结构的信息。单一独立表征技术所获得的信息通常不足以提供理解理化性质所需的充分信息。因此，通常需要结合多种光谱学和显微技术所提供的互补信息，以更深入地了解复杂系统、其结构与功能、以及与其他系统的相互作用等。

在分析包含“软”系统和“硬”系统组合或其界面的体系时，一个最常见且往往令人困扰的问题是：难以同时对“软”材料（例如生物物种）和相对较硬的材料（例如金属或聚合物医疗设备）进行成像，并获取关于不同材料特性的信息。对于此类问题，尤其是涉及多学科研究时，能够同时应用一种或多种表征技术以提取信息的混合或多模式仪器已取得巨大成功。这些混合仪器集成了多种分析技术。一个常见的例子是在提供结构和形态信息的电子显微镜中加入用于化学分析的能量色散X射线（EDX）。扩展此类混合仪器的方法将显著影响医疗设备的研究，有助于更好地理解界面相互作用，例如设备与其生物环境之间的相互作用。本章将讨论独立表征技术探测固体表面生物相互作用的能力与局限性，以及用于多模式表征的混合工具的发展，以及这些新仪器在纳米尺度上研究此类“生物/非生物”相互作用的独特可能性。

2. 前沿技术概述

以下简要概述了一些常用的表征技术，这些技术可用于在纳米尺度上研究固体表面上的生物相互作用，并提供化学、机械和电学信息。本节讨论了前沿技术，包括原子力显微镜（AFM）、扫描近场光学显微镜（SNOM）、针尖增强拉曼光谱（TERS）以及共焦激光扫描显微镜。

2.1. 扫描探针显微镜 (SPM)

SPM 是一种高分辨率成像技术，能够利用尖锐探针测量纳米尺度表面特征并研究纳米尺度表面性质。最常见的扫描探针技术包括扫描隧道显微镜（STM）、原子力显微镜和扫描近场光学显微镜。

STM 在导电材料上表现最佳，而原子力显微镜可用于研究导体和绝缘体。扫描近场光学显微镜克服了光学显微镜方法的远场光衍射极限，以获取关于纳米结构光学性质的信息。

2.1.1. 原子力显微镜

在原子尺度上研究表面是原子力显微镜发明背后的核心思想。其高分辨率成像能力，结合在纳米尺度上测量和操控物质的能力，以及在常温空气或液体环境中良好工作的特性，使原子力显微镜成为生物和非生物系统中材料表征的极为强大的工具。这种基于探针的技术可通过常规扫描获得高度和表面粗糙度测量结果，提供三维表面形貌信息，而其他光学和电子显微技术仅能提供二维信息。该技术可用于探测生物分子、它们与固体表面的相互作用，甚至实现 in situ 实时监测。

由于原子力显微镜能够在生物物种的天然环境中良好工作，因此在研究生物体和生命过程（图1）时，它已成为首选技术。该技术无需真空环境即可运行，且样品制备简单，无需特殊处理或涂层，使其成为成像原始表面的理想选择。由于原子力显微镜在成像过程中不使用任何光学镜头，因此在图像分辨率方面不受衍射极限或像差问题的影响。原子力显微镜的横向分辨率主要取决于成像所用探针的尖锐程度。

尽管原子力显微镜被广泛用作一种成像技术，但它还可以监测原子力显微镜探针与样品表面之间的其他相互作用，以获得研究材料的局部物理和化学性质。这些技术根据其所监测的相互作用命名，例如静电作用力（静电作用力显微镜 [EFM]）、磁力（磁力显微镜 [MFM]）等。力谱学是原子力显微镜的另一项主要应用，通过监测探针与样品之间的吸引、排斥和粘附相互作用来进行灵敏的力测量。

然而，尽管传统原子力显微镜是探测细胞表面、操控特定分子、测量分子间键强度、获取生化、电学和机械信息等方面的理想工具，但由于其相对较慢的扫描速度，使其在观察动态过程方面的能力受到限制。这一局限性在很大程度上已被最近的技术进展所解决。高速扫描技术的进步。另一个缺点是扫描区域相对较小，最大为 ∼150 × 150 µm。由于扫描时垂直范围有限，也难以对形貌变化较大的表面进行成像。对于表面轮廓分析，尽管原子力显微镜能够以纳米尺度分辨样品表面的物理特征，但在识别表面存在的化学物质种类方面能力有限。原子力显微镜的横向力显微术和相位对比成像模式可用于分辨表面的化学特异性，但如果存在多种化学物质，则无法可靠地有效识别。该技术的另一局限性在于其无法检测亚表面界面和嵌入式特征。一种有效克服原子力显微镜这些局限性的方法，特别是针对生物标本，是将其与荧光显微镜结合，从而获得高分辨率的表面形貌以及可靠的生化识别结果。

2.1.2. 扫描近场光学显微术

传统光学显微术技术受衍射限制，但扫描近场光学显微镜通过使用亚微米光学探针在小于照明光波长的距离上扫描样品表面，能够克服这一限制。在扫描近场光学显微镜中，图像的分辨率由探针尺寸和探针与样品之间的间距决定。这种非衍射受限成像能够在高空间分辨率下利用所有远场光学增强对比机制，以研究系统在纳米尺度下的光学性质。扫描近场光学显微镜在纳米结构研究中非常有用，因为它可以从样品表面获取形貌和光学数据，有助于理解物理结构与光学对比度之间的关系。除了成像之外，扫描近场光学显微镜还可以结合光谱分析，获得所研究系统的化学和结构信息。

作为一种基于探针的技术，扫描近场光学显微镜会受到探针与样品相互作用的影响，并且仅限于表面研究。与原子力显微镜类似，对较大表面区域进行成像需要更长的时间。由于近场成像所需的极小工作距离，可能会带来困难。用于研究形貌发生大尺度变化的表面。此外，它还存在与探针扫描相关的伪影问题，包括探针和样品损伤。

2.2. 共聚焦显微镜

该光学成像技术的一些主要优势在于其能够滤除离焦光，从而提高图像质量；可以从选定深度采集高分辨率和高对比度的二维图像；能够通过厚样本的光学切片重建三维结构，进而实现对样本内部的可视化。在共聚焦荧光显微镜中，对于不透明样本中无法通过原子力显微镜或扫描近场光学显微镜检测的亚表面界面和嵌入式特征，可借助特定的荧光团进行成像。这些荧光染料可实现对目标功能更清晰、更精确的检测，并能高精度地进行映射。在使用单色激光器激发样本的共聚焦激光扫描显微镜中，可以选择非常特定的荧光激发波长，从而实现多种荧光团同时标记同一样本的不同区域。该技术还可用于获取不透明样本大范围区域的表面轮廓。光学切片的概念避免了样品制备过程中物理切片可能引入的人工伪影。

由于焦深高度受限，来自样品内部区域的图像质量得到改善，因为特定深度层面的图像信息不会与其他深度的图像信息重叠。然而，共聚焦显微镜中的成像深度受光学穿透和信噪比的限制。尽管共聚焦荧光显微镜在绘制光学编码功能方面有效，但当涉及无法用荧光染料标记的样本时，该技术效率不高。荧光团的光漂白也可能导致样本无法用于共聚焦成像。

对于无法进行荧光标记或不具备电子对比度的研究系统，存在一种需求——一种敏感的技术，可根据化学成分理想地识别组分。在这种情况下，可以利用拉曼或红外光谱。

2.3. 拉曼光谱

拉曼光谱基于单色光的非弹性散射，可提供有关化学键和分子对称性的信息。拉曼散射本身是一种微弱的现象，其散射强度比主导地位的瑞利散射或荧光低几个数量级。研究发现，如果分析物分子吸附在某些金属表面或金属纳米粒子上，拉曼信号可以显著增强。这种效应被称为表面增强拉曼散射（SERS），归因于局域表面等离子体共振的激发以及化学吸附物种与金属表面之间的电荷转移。金、银、铜等是表现出SERS效应最常用的金属表面。

从拉曼光谱数据中可以获得丰富的化学信息，但该技术缺乏纳米尺度表征所需的高空间分辨率。研究发现，如果原子力显微镜探针涂覆有具有SERS活性的金属，则在原子力显微镜探针附近的样品表面区域内，可实现拉曼信号强度的空间选择性增强。这种现象被称为针尖增强拉曼光谱技术（TERS），它结合了原子力显微镜的高空间分辨率和拉曼光谱提供的化学特异性，能够唯一识别样品表面上存在的不同化学物质。作为一种基于探针的技术，TERS所能实现的空间分辨率仅受限于原子力显微镜探针的尺寸和形状。同时采集表面形貌和光谱数据，可以实现样品表面物理结构与化学分布之间的关联。

TERS针尖是进行TERS测量最重要的组件之一。它也是主要的限制因素之一，因为难以制造出具有高增强因子的可重复且耐用的探针。

3. 原子力显微镜‐扫描近场光学显微镜‐针尖增强拉曼光谱技术‐共聚焦显微镜的联用

如果将SPM与光学显微镜以及拉曼光谱相结合，则可以提供一个理想的平台，同时获取样品表面的物理、化学、结构和光学信息。可以使用SPM在环境空气或液体环境中探测固体表面上的生物相互作用。它能够提供有关各种表面性质的信息，包括形貌、相位、弹性、摩擦、表面电势、磁化、压电响应、电导率、电容等。由于SNOM和TERS是基于探针的技术，当它们与SPM集成时，可以同时提取这些生物相互作用的化学和光学信息。SNOM能够在纳米尺度上研究光学性质，而TERS则能够整合化学分析，并提供有关分子键和相互作用的信息。

全球不同的商业制造商以及研究团队都曾尝试结合一种或多种技术，以深入了解这些纳米尺度现象。在本节中，我们将讨论安装在利默里克大学的一种独特的混合仪器——NTEGRA Spectra 来自NT‐MDT。该混合纳米显微镜将多模式扫描探针显微镜与光学近场、远场显微镜以及化学成像和光谱学相结合。

NTEGRA Spectra 将原子力显微镜、共聚焦拉曼、荧光显微镜、针尖增强拉曼光谱技术以及扫描近场光学显微镜集成于一个平台。当作为常规扫描探针显微镜使用时，该仪器能够通过多种原子力显微镜模式获取样品的物理、纳米力学和电学性质信息，并实现高空间分辨率的样品可视化。仪器配备有电学、电化学、静电、磁性、声学和压电测量模块。样品的电学特性可通过电场力显微镜或扫描开尔文探针力显微镜（SKM）进行研究。其他可用于研究表面特性的原子力显微镜模式包括：用于研究局域电子结构的扫描扩展电阻显微镜（SSRM）和扫描电容显微镜（SCM）、用于探测磁相互作用的磁力显微镜（MFM）、用于成像和操控铁电畴的压电响应力显微镜（PFM）等。该仪器还可用于进行扫描隧道显微镜测量。

SPM基座单元包含测量头、扫描器和样品台。根据特定用途，SPM有两种不同的配置——直立式（图3）和倒置式装置（图4）。直立构型针对不透明样本进行了优化，而倒置式装置则可放置在倒置显微镜（奥林巴斯）上方，用于研究透明样品。通过倒置式装置，该仪器可用作共聚焦激光扫描显微镜，能够利用先进的光学成像模式收集表面的高分辨率光学数据。

显微镜单元集成了用于拉曼分析的光谱部件。该光谱仪配备了三种不同的激光激发源（473 nm（蓝色）、532 nm（绿色）、633 nm（红色）），并可全自动切换不同激光。该仪器可单独作为常规光谱仪使用，能够获取所研究不同表面的光谱测量结果。结合SPM单元，可同时获得AFM和拉曼成像。

4. 混合型纳米显微镜的优势

在材料、半导体、生物与生物技术研究的新进展中，从不同角度获得对系统的详细理解至关重要。由于这种混合仪器集成了多模式扫描探针显微镜、光学显微镜和高空间分辨率拉曼光谱仪，因此可以在单次实验中提供具有不同特征的多种类型数据。能够在纳米尺度上同时测量电学、力学和化学性质。可研究的样品范围广泛，包括聚合物、陶瓷、半导体以及活细胞、组织和生物医学器件。系统中的单个纳米实体可以得到更详细的分析，并可提取其内部与外部相互作用的信息。可在干燥、湿润和生理条件下，对细胞、蛋白质、组织、凝胶、聚合物等“软”系统进行高分辨率成像以及化学、电学、机电和电化学分析。由于这种集成化设计，复合材料的研究将更加高效。

方法以及不同材料组分的响应可以同时被识别。原位监测生物和生理过程可在水环境中进行，以捕捉纳米尺度下的系统转变和活性过程。在环境条件下，可对同一感兴趣区域进行实时化学和形貌成像。可对软系统（如生物系统）与相对硬系统（如金属、陶瓷或聚合物）之间的界面进行成像。由于原子力显微镜与共聚焦拉曼和荧光显微镜的联用，标记和无标记生物样本均可被详细研究。这种联用不仅有助于研究表面特征及其他表面现象，还可深入探究亚表面和嵌入结构。此外，还可开展针对各类系统的温度和时间依赖性研究。

这种集成方法还消除了在不同仪器间转移样品时寻找相同观测区域的需求，从而避免了这一固有缺陷。一旦在样品上找到合适的感兴趣区域，便可在一次实验中完成多种测量。由于该仪器允许在不将样品移出原子力显微镜样品腔的情况下检测多种性质，因此可以对组织、细胞等脆弱样品进行详细研究，而不会因物理移动、温度或湿度变化或其他环境因素造成损伤。对于 in vivo 或 in vitro 研究，即使样品正在发生转变，仍能从样品的同一位置同步获取形貌和光谱数据，确保数据的一致性和准确性。使用此类混合纳米镜所能开展的大多数分析本质上均为非破坏性。因此，可对脆弱样品进行物理和化学检测而不造成损伤。

因此，这一结合了原子力显微镜、扫描近场光学显微镜、共聚焦拉曼和荧光显微镜独特功能的单一平台，有望融合科学领域的不同学科，并更轻松地以更精细的细节探索复杂系统。

5. 结论

生物材料的电学性质源于其组成成分的化学性质，并受其影响。因此，需要同时测量电学性质和化学性质，以及形貌、形貌和结构。特别是在需要高空间或深度分辨率的情况下，对相对较硬的生物材料上的“软”生物物种进行成像十分困难。多模态成像方法是应对这一科学挑战的可行途径，目前市场上已有一些商用仪器可用于解决此类挑战。