TPP及CETSA助力天然产物的研发及研究

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#TPP #CETSA #药物研发 #天然产物 #药物靶点筛选

于 2025-05-15 09:17:42 首次发布

更多详细信息请见：最经典、主流的药物靶点筛选技术——TPP热蛋白组分析

在当今药物研发领域，天然产物以其独特的化学结构、多样的生物活性和良好的生物相容性，一直是创新药物研发的研究重点。据统计，自1981年至2019年9月，超过60%的FDA批准的小分子药物直接或间接来源于天然产物。然而，靶点识别作为天然产物药物研发的关键环节之一，却面临着诸多挑战。传统的靶点识别方法往往需要对天然产物进行化学修饰，或依赖于间接的表型分析和多层级的信号网络分析，过程繁琐且易产生假阳性结果。近年来，细胞热位移测定（CETSA）和热蛋白组分析（TPP）的出现，为天然产物的靶点识别和药物研发提供了全新的方法。

一、CETSA：基于热稳定性的靶点识别方法

CETSA是一种无需标记的生物物理检测技术，其原理是基于配体与靶蛋白结合后可增强靶蛋白的热稳定性。在CETSA实验中，样品（如完整细胞、细胞裂解液或组织样本）经天然产物处理后，进行梯度热处理，使未结合天然产物的蛋白变性沉淀，而结合天然产物的蛋白则保持相对稳定。通过检测热处理后剩余的可溶性蛋白，可建立蛋白的热熔曲线，并计算出蛋白的熔解温度（Tm）。天然产物与靶蛋白结合后，会导致靶蛋白的热熔曲线发生偏移，Tm值发生变化，从而间接反映天然产物与靶蛋白的结合情况。

CETSA流程图

二、TPP：无偏倚的蛋白质靶点识别方法

TPP是CETSA的衍生策略之一，其通过引入多复用定量质谱检测平台，实现了在细胞环境中对蛋白质组范围内蛋白热稳定性的同时测量。与传统的基于Western blot的CETSA相比，TPP具有更高的通量和更广泛的覆盖范围，能够无偏倚地识别天然产物的潜在蛋白靶点。

TPP主要分为以下两种类型：

1.TPP-温度范围（TPP-TR）：在固定药物浓度下，检测不同温度点下蛋白质组的热稳定性变化。通过分析蛋白质的热熔曲线和Tm值的变化，可鉴定出与天然产物相互作用的蛋白靶点。

2.TPP-化合物浓度范围（TPP-CCR）：在固定温度下，检测不同药物浓度下蛋白质组的热稳定性变化。通过计算各蛋白的剂量-反应曲线和pEC50值，可进一步验证天然产物与蛋白靶点的结合，并评估其结合亲和力。

此外，TPP技术还衍生出了多种改进方法，如二维TPP（2D-TPP）、细胞表面TPP（CS-TPP）、简化版TPP（STPP）、基于热稳定性变化的二维凝胶电泳荧光差异分析（TS-FITGE）和沉淀支持的TPP（PSTPP）等，这些方法在提高TPP的灵敏度、特异性和成本效益方面发挥了重要作用。

TPP流程图

三、CETSA及TPP在天然产物研究中的应用

1. 靶点验证

CETSA可为天然产物的靶点验证提供直接证据。通常利用CETSA在疾病相关细胞系统中进行验证，将待验证的靶标与观察到的天然产物引起的表型关联在一起。先前研究表明，在骨肉瘤U2OS细胞裂解物中，tubocapsenolide A和SHP 2之间的直接相互作用能够影响骨肉瘤的治疗效果，这一结果为后续的药物开发奠定了基础。

2.靶点发现

TPP能够无偏倚地识别天然产物的直接和间接靶点。TPP相关研究表明，研究人员通过从星孢链霉菌中分离出泛激酶抑制剂星孢菌素的热蛋白质组，进一步在K562细胞裂解物中成功发现了51个激酶靶标以及2个意外靶标，展示了TPP在靶点发现中的强大潜力。

3.药物筛选

药物研发通常从高通量筛选开始，其目的是快速鉴定具有开发为针对目标蛋白质的药物的潜力的化合物。通过使用高通量CETSA结合均质检测平台，可以实现药物库中化合物与靶点结合的高通量测量，目前这种高通量CETSA已成功应用于多种靶点结合物的筛选，如先前的一篇研究通过AlphaScreen-CETSA平台在活K562癌细胞中鉴定有效的胸苷酸合酶（TS）抑制剂，从10,928个化合物中筛选出65个活性化合物。
CETSA药物研发流程图