Cut&Tag-Seq

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原创最新推荐文章于 2026-06-01 10:15:54 发布 1.4k 阅读 AI 写同款· GEO 优化 ›

CUT&Tag：引领新一代ChIP-Seq技术革命近岸蛋白质开发了ChiTag酶和CUT&Tag技术。CUT&Tag是一种革命性的新技术，它不需要甲醛交联和免疫共沉淀，即可特异性的将目的蛋白附近的DNA片段直接连上接头并打断，进行高通量测序。该方法可一管式高通量应用，或在单细胞研究中使用。该方法使用了ChiTag酶，可以在打断基因组的同时加上接头，不需要繁琐的补平加A加接头，并且可在一天内完成从细胞到测序文库制备全流程。阅读详情

Cut&Tag-Seq（Cleavage Under Targets and Tagmentation Sequencing）是一种结合抗体标记、限制性酶切和高通量测序的表观基因组学技术，用于检测染色质修饰和蛋白质-DNA相互作用。它是一种高效、灵敏且低背景的替代技术，常被用来研究组蛋白修饰、转录因子结合位点和染色质状态。

以下是关于Cut&Tag-Seq的介绍：

工作原理

Cut&Tag-Seq基于目标蛋白特异性抗体的结合，通过将DNA片段化并直接准备测序文库，实现蛋白质结合位点或表观修饰的高分辨率检测。它的主要步骤如下：

1. 样品制备

使用活细胞、细胞核或固定组织。
样品固定通常可选，允许在天然条件下保持染色质状态。

2. 样品标记

用特异性的一抗（针对目标蛋白质或组蛋白修饰，如H3K27me3）结合到目标区域。
加入带Fc片段结合域的次抗，用于连接蛋白A或蛋白G。

3. 定位与剪切

加入融合有Tn5转座酶的蛋白A/G（pA-Tn5），该转座酶与抗体复合物结合在目标区域。
激活Tn5酶，使其在目标蛋白附近的DNA上进行切割和接入文库序列（tagmentation）。

4. 文库构建

经剪切的DNA片段直接带有文库接头，简化后续文库制备步骤。
放大文库以用于高通量测序。

5. 测序与数据分析

通过高通量测序获得片段信息。
数据分析涉及比对、峰值检测、注释和功能富集分析，以识别特定的蛋白质结合位点或染色质修饰。

技术特点与优势

高灵敏度和低背景噪声
- 因为Tn5转座酶在目标区域直接接入文库序列，非特异性背景显著减少。
低样本需求
- 适合于稀有细胞群体或单细胞分析，最低样本量可达几千个细胞。
快速简便
- 样品制备到文库构建仅需一天，减少繁琐的实验步骤。
无需交联和超声
- 可在非固定样品中直接操作，避免化学交联引入的伪影。
高分辨率
- 数据可精确到碱基级别，适用于分析精细的染色质特征。

与其他技术的比较

技术	特点	样本需求	背景噪声	实验复杂性
ChIP-Seq	经典方法，需交联、超声处理	高（>10⁶个细胞）	高	较复杂
CUT&RUN	类似技术，但需额外步骤释放DNA	中（~10⁴细胞）	低	较简单
ATAC-Seq	聚焦开放染色质区域	低（~10³细胞）	中	简单
Cut&Tag-Seq	针对性强，灵敏度高	低（~10³细胞）	最低	最简单

适用范围

组蛋白修饰
- 如H3K27me3（抑制标记）、H3K4me3（激活标记）等。
转录因子结合位点
- 鉴定转录因子如何与DNA结合以调控基因表达。
表观基因组学研究
- 分析染色质状态（开放或封闭）。
疾病相关研究
- 探索癌症或其他疾病中的表观遗传变化。
单细胞水平分析
- 与单细胞技术结合，可用于异质性研究。

挑战与优化方向

抗体依赖性
- 需要高特异性的抗体，否则会引入非特异性信号。
酶效率与均一性
- Tn5转座酶的活性和剪切效率可能因实验条件而异。
数据分析
- 高通量测序数据处理和分析需要专业工具和算法。

Cut&Tag-Seq的出现为表观遗传学研究提供了革命性的工具，其高效、低背景和广泛适用性使其成为研究染色质状态和基因调控机制的首选方法之一。

以下是一个基于常用工具（如Trim Galore!、Bowtie2、samtools、MACS2等）的Cut&Tag-Seq分析代码流程，涵盖从原始数据处理到峰值调用和注释的完整分析步骤。该流程适用于Linux或macOS系统。

1. 原始数据质控

使用FastQC和MultiQC检查原始数据质量。

# 创建输出目录mkdir -p QC/raw# 运行FastQCfastqc -o QC/raw *.fastq.gz# 整合FastQC报告multiqc -o QC/raw QC/raw

2. 数据修剪

使用Trim Galore!去除接头序列和低质量碱基。

# 创建输出目录mkdir -p trimmed# 运行Trim Galore!for file in *.fastq.gz; do    trim_galore --paired --output_dir trimmed $filedone

3. 对齐到参考基因组

使用Bowtie2进行比对，推荐使用染色体索引的基因组版本（如hg38或mm10）。

# 创建输出目录mkdir -p alignment# 对齐到基因组for file in trimmed/*_val_1.fq.gz; do    base=$(basename $file _val_1.fq.gz)    bowtie2 -x /path/to/genome_index \            -1 trimmed/${base}_val_1.fq.gz \            -2 trimmed/${base}_val_2.fq.gz \            -S alignment/${base}.samdone

4. SAM文件转换与过滤

使用samtools将SAM转换为BAM并进行过滤（如仅保留唯一比对的片段）。

# 创建输出目录mkdir -p bam filtered# SAM转BAM，排序并过滤for file in alignment/*.sam; do    base=$(basename $file .sam)    samtools view -bS $file | \    samtools sort -o bam/${base}.sorted.bam    samtools index bam/${base}.sorted.bam
    # 过滤低质量比对    samtools view -b -q 30 bam/${base}.sorted.bam > filtered/${base}.filtered.bam    samtools index filtered/${base}.filtered.bamdone

5. 去除PCR重复

使用Picard或samtools去除重复。

# Picard工具去重复mkdir -p dedupfor file in filtered/*.bam; do    base=$(basename $file .filtered.bam)    java -jar picard.jar MarkDuplicates \        I=$file \        O=dedup/${base}.dedup.bam \        M=dedup/${base}.metrics.txt \        REMOVE_DUPLICATES=true    samtools index dedup/${base}.dedup.bamdone

6. 峰值调用

使用MACS2进行峰值调用。

# 创建输出目录mkdir -p peaks# 峰值调用（根据实验设计选择模式，如单端或成对）for file in dedup/*.dedup.bam; do    base=$(basename $file .dedup.bam)    macs2 callpeak -t $file \        -f BAM -g hs \        --outdir peaks/${base} \        -n ${base} \        --keep-dup all \        --nomodel --shift -100 --extsize 200done

7. 峰值注释

使用Homer或ChIPseeker进行注释。

使用Homer：

# 创建输出目录mkdir -p annotationfor file in peaks/*/NA_peaks.narrowPeak; do    annotatePeaks.pl $file hg38 > annotation/$(basename $file .narrowPeak).txtdone

使用R和ChIPseeker：

library(ChIPseeker)library(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg38.knownGene)# 读取峰值文件peak_file <- "peaks/sample/NA_peaks.narrowPeak"peaks <- readPeakFile(peak_file)# 注释txdb <- TxDb.Hsapiens.UCSC.hg38.knownGenepeak_anno <- annotatePeak(peaks, TxDb = txdb)plotAnnoPie(peak_anno)

8. 数据可视化

生成bigWig文件用于浏览器展示：

# 创建bigWig文件mkdir -p bigwigfor file in dedup/*.dedup.bam; do    base=$(basename $file .dedup.bam)    bamCoverage -b $file -o bigwig/${base}.bw --normalizeUsing CPMdone

将生成的bigWig文件上传到基因组浏览器（如UCSC或IGV）以进行可视化。

9. 差异分析

对于多组比较，使用DiffBind或其他差异分析工具。

library(DiffBind)# 加载样品信息samples <- read.csv("sample_sheet.csv")# 创建DiffBind对象dbObj <- dba(sampleSheet=samples)# 差异分析dbObj <- dba.contrast(dbObj, categories=DBA_CONDITION)dbObj <- dba.analyze(dbObj)dba.report(dbObj)

以上流程可以根据实验设计灵活调整。确保安装好相关工具和依赖库。

生信大白记第45记，就到这里，关注我！

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