【技术应用】微蛋白怕漏检？组学联合方案重塑微蛋白研究范式

1 微蛋白：被忽视的生命调控者

随着生物信息学分析以及转录组学、翻译组学和质谱技术的不断进步，越来越多的研究揭示出一类长期以来被忽视的基因组元件——含有短开放阅读框（small open reading frames, sORFs）的RNA分子。这些RNA由于其编码序列极短，往往在传统注释流程中被误认为是非编码RNA（non-coding RNAs），从而被排除在蛋白质编码基因的范畴之外。然而，近年来的研究表明，这些sORFs实际上能够翻译出长度远低于传统标准的微小蛋白质（small proteins，亦称microproteins或miniproteins，SPs）。根据定义，这类微蛋白在真核生物中通常由少于100个氨基酸组成，在原核生物中则少于50个氨基酸，虽然体积微小，却在调控多种关键的生物学过程和维持细胞稳态中发挥着不可忽视的作用。它们的功能形式多样，既可以作为独立的功能单位直接参与信号传导、代谢调控等过程，例如作为信号分子或配体激活受体通路；也可以通过与较大的调控蛋白相互作用，调节其活性、稳定性或亚细胞定位，从而间接影响细胞行为。随着研究手段的不断进步，越来越多的微蛋白被鉴定和功能解析，揭示了基因组中“暗物质”区域蕴含的潜在生物学意义，为理解生命活动的复杂性提供了新的视角。这一领域的快速发展不仅拓展了我们对蛋白质编码基因的传统认知，也为疾病机制研究、新型生物标志物开发和靶向治疗策略提供了新的研究方向。

2 Ribo-seq技术简介

Ribo-seq作为解析体内翻译动态的核心技术，通过捕获与核糖体结合的RNA片段（即长约30个核苷酸的核糖体保护片段，RPFs），结合高通量测序手段实现对翻译过程的解析。其技术本质在于利用核酸酶处理保留核糖体- RNA复合物，进而精确绘制核糖体在转录本上的定位图谱。通过与RNA-seq数据的系统性联合分析，Ribo-seq可量化计算翻译效率（Translation Efficiency，TE），揭示基因表达在转录后调控层面的关键机制；同时，该技术还能与长链非编码RNA（lncRNA）及环状RNA（circRNA）研究相结合，高效鉴定传统注释遗漏的小开放阅读框及其编码的微蛋白，可以显著拓展蛋白质组的认知边界，发现更多“隐藏蛋白”。

图 核糖体足迹分析概述（Brar G A and Weissman J S., 2015）。

3 破局之道：组学联检技术矩阵

目前主流的SPs识别方法主要包括三种：核糖体分析技术（ribosome profiling，Ribo-seq）、质谱分析（mass spectrometry，MS）及生物信息学预测。Ribo-seq通过高通量测序手段捕捉核糖体保护的开放阅读框（ORFs）片段，从而推断哪些区域正在进行翻译活动；而质谱技术则通过测量肽段的质荷比，实现对翻译产物的直接识别与定量，从而验证SPs的存在。如果想尽量全面地进行SPs可以通过多技术联合矩阵。

然而，尽管这些方法在常规蛋白质的识别中表现优异，却在面对低丰度、小分子、瞬时表达或组织特异性表达的SPs时面临诸多挑战。例如，Ribo-seq受限于实验条件和样本状态，只能检测在特定条件下活跃表达的转录本；而质谱技术受限于检测灵敏度和肽段特性，常常难以捕获那些尺寸微小、丰度极低或仅在特定生理状态下表达的SPs。如果从不同层面全面捕获SPs的翻译与表达信息，可以显著提升SPs识别的准确性与覆盖度。

4 标杆案例：改写教科书级发现

案例1

• 文章题目：LncRNA HCP5-encoded protein regulates ferroptosis to promote the progression of triple-negative breast cancer

• 发表期刊：Cancers（IF=4.4）

• 主要技术：Ribo-seq、MS

• 研究思路：

• 研究结果：

图 LncRNA HCP5编码蛋白质并且在TNBC细胞系中内源性上调（Tong et al., 2023）。

案例2

• 文章题目：Profiling mouse brown and white adipocytes to identify metabolically relevant small ORFs and functional microproteins

• 发表期刊：Cell metabolism（IF=30.9）

• 主要技术：Ribo-seq、RNA-seq、MS

• 研究思路：

• 研究结果：

图 Ribo-seq用于分析微蛋白（Martinez et al., 2023）。

图 Gm8773的翻译、表达和活性（Martinez et al., 2023）。

Ribo-seq

Ribo-seq作为解析体内翻译动态的核心技术，通过捕获与核糖体结合的RNA片段（即长约30个核苷酸的核糖体保护片段，RPFs），结合高通量测序手段实现对翻译过程的解析。其技术本质在于利用核酸酶处理保留核糖体- RNA复合物，进而精确绘制核糖体在转录本上的定位图谱。通过与RNA-seq数据的系统性联合分析，Ribo-seq可量化计算翻译效率（Translation Efficiency，TE），揭示基因表达在转录后调控层面的关键机制；同时，该技术还能与长链非编码RNA（lncRNA）及环状RNA（circRNA）研究相结合，高效鉴定传统注释遗漏的小开放阅读框及其编码的微蛋白，可以显著拓展蛋白质组的认知边界。

参考文献

[1] Brar G A, Weissman J S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis[J]. Nature reviews Molecular cell biology, 2015, 16(11): 651-664.

[2] Tong X, Yu Z, Xing J, et al. LncRNA HCP5-encoded protein regulates ferroptosis to promote the progression of triple-negative breast cancer[J]. Cancers, 2023, 15(6): 1880.

[3] Martinez T F, Lyons-Abbott S, Bookout A L, et al. Profiling mouse brown and white adipocytes to identify metabolically relevant small ORFs and functional microproteins[J]. Cell metabolism, 2023, 35(1): 166-183. e11.