蛋白表达系统之哺乳动物细胞表达系统

自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，科学家们又推动了重组技术、纯化指南和性质鉴定等技术的急剧发展，蛋白表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。而利用表达系统表达出目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，这些“carriers”将外源基因运载到宿主细胞中，然后被转化成蛋白。经过许多年的发展，蛋白生产能力的提高已经在进一步理解基因的功能和所编码蛋白的功能和相互作用等方面起到了积极作用，也将为寻找如单克隆抗体等治疗性蛋白打下基础。

一、蛋白表达系统

蛋白表达是一种利用原核表达系统或真核表达系统来进行外源基因的分子生物学技术，对于生物体的正常生长发育和维持生命功能至关重要。蛋白表达系统通常由宿主、外源基因、载体和辅助成分四部分组成。宿主是用来表达外源基因的生物体，可以是细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种宿主生物本身的特性多种多样，不同的蛋白需要选择合适的宿主进行表达。载体中含有外源基因片段，外源基因通过载体介导，转入宿主中表达。而载体的选择需要与宿主相匹配，根据宿主不同，分为原核（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。

二、蛋白表达系统的分类

蛋白的表达系统一般可以分为：

1.原核表达系统是指在细菌中表达蛋白质的系统。原核表达系统具有简单、高效、易于扩大规模的优点，广泛用于生产大量纯化蛋白质。原核表达系统可以分为两种类型：大肠杆菌表达系统和其它细菌表达系统。大肠杆菌表达系统是研究最早、最为成熟也最为常用的表达系统，也是我司常用于重组蛋白制备的表达系统之一。原核表达系统具有成本低、表达量高等优点，但缺乏翻译后修饰机制，不适用于需要糖基化或特定位点切割等修饰的蛋白表达。

2.真核表达系统是指在真核细胞中表达蛋白质的系统，可以实现不同程度的糖基化等翻译后修饰，更接近于来自真核蛋白的天然活性。真核表达系统可以分为四种类型：酵母表达系统、昆虫表达系统、植物细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

酵母表达系统中常用的酵母细胞包括酿酒酵母、毕赤酵母等，酵母细胞生长速度快、培养条件简单，既可高密度发酵又可以进行正确的蛋白质折叠和翻译后修饰，是一种良好的蛋白表达系统。该系统可以实现大量表达蛋白质，并且具有易于纯化和高度可控的优点。

昆虫细胞表达系统是一种真核蛋白高表达体系，适合于一些在原核体系难以表达的蛋白，比如膜蛋白、大分子质量蛋白、蛋白激酶等。常用的昆虫表达系统包括杆状病毒表达系统、多角体病毒表达系统。

植物细胞表达系统通常使用农杆菌介导的转化方法，将表达载体导入到植物细胞中进行表达。植物细胞具有高效的蛋白质修饰和表达能力，同时还可以进行正确的蛋白质折叠和组装。这种表达系统不仅能够表达蛋白质，还可以进行疫苗和生产重组蛋白质等方面的应用。

哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白，在活性方面也远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，但构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低。

3.无细胞表达系统：可以从质粒和PCR产物直接表达目的蛋白，表达体系是来自于大肠杆菌、麦胚、兔网织红细胞等的无细胞提取物。无细胞蛋白表达的优点是可自动化表达其它系统难以表达的产物，通量高，但表达量低、成本高昂。

三、哺乳动物细胞蛋白表达系统

制备高质量、高纯度、高天然保真性的蛋白，是许多生物医学实验研究中关键性的一步，其中哺乳动物表达系统能实现蛋白质高效表达、翻译后的修饰以及正确的折叠复性，使其更接近天然蛋白，在活性方面远高于其他表达系统，因此哺乳动物表达系统在生物医学和药学研究中具有不可替代的作用。

将外源基因导入哺乳动物细胞内进行蛋白表达主要有两类方法，一类是采用非病毒载体的方式将外源基因导入到宿主细胞中，比如转染质粒法（脂质体转染、电转）、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE-葡聚糖法等；二是利用携带外源基因的病毒载体感染宿主细胞，比如常用的慢病毒、腺病毒和腺相关病毒等。

3.1哺乳动物细胞表达载体

哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件：

1.原核序列中包括：原核复制子、抗生素抗性基因和多克隆位点。

2.启动子：分为两类，一是病毒来源的SV40、CMV、RSV、ADV和LTR启动子；二是细胞来源的HSP启动子。

3.增强子：是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，常用增强子有SV40 enhancer、CMV enhancer、RSV enhancer和LTR enhancer等。

4.选择标记基因：新霉素抗性基因（neo）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）和胸苷激酶基因（tk）等。

5.终止子和polyA信号：功能是使转录后的mRNA能有效进行切割和加上polyA尾巴也就是多聚腺苷化，polyA增加mRNA的的稳定性。多聚腺苷化所需的两种序列一是位于polyA下游GU丰富区或U丰富区；二是位于polyA上游11-30bp处的5’–AAUAAA。

下图是哺乳动物细胞表达系统常用载体pcDNA3.1(+)的图谱，它可在多种哺乳动物细胞系中实现高表达。从图谱中可以看到CMV、SV40、AmpR和T7启动子，SV40 enhancer、CMV enhancer增强子，氨苄和新霉素抗性基因，SV40 polyA信号等主要元件。

图1 来源于Snap Gene官网

3.2哺乳动物细胞表达流程

1.选择宿主细胞：根据研究方向和蛋白特点，选择适合的宿主细胞，目前常用的细胞有293T细胞，CHO细胞和Hela细胞等。

2.构建表达载体：根据实验需求及外源基因特点选择相应病毒载体或普通过表达载体，我司常用的普通过表达载体为pcDNA3.1(+)载体。

3.转染或感染：根据宿主细胞的转染难度和实验目的，选择非病毒或病毒法导入宿主细胞进行蛋白表达。

4.选择表达细胞株：一般可根据荧光或抗生素筛选的方式进行选择表达细胞株。

5.表达和纯化：目的蛋白通常采用亲和层析、离子交换层析或凝胶过滤层析等方法进行纯化。

6.鉴定和检测：目前常用的检测方法有SDS-PAGE、Western blot或质谱分析等。

7.应用：经纯化质检的蛋白，可用于酶活检测分析、药物筛选分析、抗原抗体制备筛选和免疫印迹等方面。

图2 哺乳动物细胞利用慢病毒大规模表达可溶性或膜蛋白的示意图（Elegheert et al., 2018）。

3.3哺乳动物细胞表达系统优缺点

优点：

1.蛋白表达水平和活性高

2.表达迅速且高效稳定

3.可实现蛋白折叠及翻译后修饰

4.可表达复杂蛋白和易于纯化的蛋白

5.适合大规模蛋白表达

缺点：

1.生产周期长

2.培养条件严格

3.操作技术难度高

4.成本高

5.效率低

参考文献

Elegheert, J., Behiels, E., Bishop, B. et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nat Protoc 13, 2991–3017 (2018).