【文献速递】当FRET遇见自噬：新一代生物传感器如何实时“看见”细胞自噬开关？

在微观的细胞世界里，一场关乎生命存续的“大扫除”——自噬，时刻都在进行。科学家们一直渴望能实时观测这一过程的启动瞬间，而荧光共振能量转移（FRET）技术的突破性应用，让这个梦想成为现实。最近，《Autophagy》期刊上发表的一项研究，展示了一款基于FRET技术的LC3B生物传感器，它如同一个分子级的“开关监视器”，让我们第一次能够在活细胞中实时、高分辨地观察自噬的启动信号。

一、技术原理

理解这个传感器的核心，首先要了解FRET技术的精妙原理。这是一种基于能量转移的物理现象：当两个荧光分子（供体与受体）距离足够近（<10纳米）时，供体的激发能量可以非辐射地转移给受体。

研究团队巧妙地将这一原理转化为分子探测器：他们将青色荧光蛋白Aquamarine（供体）和黄色荧光蛋白tdLanYFP（受体）分别连接在LC3B蛋白的两端。当这两个荧光蛋白紧挨在一起时，就会发生FRET，青色荧光被淬灭，黄色荧光增强；一旦它们被分开，FRET信号就会消失。

这个传感器的核心创新在于，将FRET信号的变化与自噬的关键生化事件直接关联：

(1)未切割状态：ATG4B蛋白酶不活跃→LC3B保持完整→供体与受体相邻→强FRET信号;

(2)切割激活状态：ATG4B切割LC3B→tdLanYFP被切离→供体受体分离→FRET信号消失。

图1 LC3B生物传感器的设计原理（Gökerküçük et al., 2023）。

二、实验结果

图2展示了在U2OS活细胞中，通过FRET-FLIM技术测量的结果。G120A是一个点突变：将LC3B蛋白序列中第120位的甘氨酸（Gly, G）突变为丙氨酸（Ala, A）。突变之后不能被ATG4B识别并切割。

左侧：细胞荧光图像（Aquamarine通道），显示LC3B斑点的分布。

右侧：对应的ΔLifetime伪彩图。

ΔLifetime (Δτ)：指供体（Aquamarine）荧光寿命的减少量。Δτ越大，表示FRET效率越高，即供体与受体距离越近（传感器未被切割）。

伪彩标尺：蓝色表示Δτ低（无FRET，传感器已被切割），红色/黄色表示Δτ高（有FRET，传感器未被切割）。

四组实验对比：

①WT Biosensor + Control siRNA：Δτ图像整体为蓝色，平均Δτ接近0。说明在基础条件下，传感器几乎被完全切割，没有FRET。

②WT Biosensor + ATG4B siRNA：Δτ图像出现局部红色/黄色区域（见放大图箭头），特别是在LC3B斑点内部或周围。这说明ATG4B敲低后，局部出现了未被切割的传感器（高FRET）。

③G120A Biosensor + Control siRNA：Δτ图像整体为亮黄色，平均Δτ值很高（~500 ps）。正如预期，这个无法被切割的突变体始终处于高FRET状态。

④G120A Biosensor + ATG4B siRNA：与对照组无差异，依然保持高FRET。

图2 FRET-FLIM技术分析LC3B生物传感器的荧光图像（Gökerküçük et al., 2023）。

这项研究展示了FRET技术在细胞生物学研究中的强大能力——将不可见的分子相互作用转化为可见、可定量的光学信号。通过巧妙的分子设计，研究者将复杂的酶促反应“翻译”成简单的荧光变化，实现了对生命过程的非侵入式、实时监测。

参考文献

Gökerküçük E B, Cheron A, Tramier M, et al. The LC3B FRET biosensor monitors the modes of action of ATG4B during autophagy in living cells[J]. Autophagy, 2023, 19(8): 2275-2295.