计算基因表达量TPM（Transcripts Per Million）值的经典步骤 gene_lengths（基因长度）是计算基因表达量时的一个关键参数

原创 已于 2025-10-06 18:51:18 修改 · 1k 阅读 · 16 ·
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#生物信息 #r语言

于 2025-10-06 18:46:03 首次发布

背景知识

gene_lengths（基因长度）是计算基因表达量时的一个关键参数，主要用于消除因基因本身长短不同而对定量结果造成的影响，让不同基因的表达水平更具可比性。

下面的表格能帮你快速理解它的核心定义和常见计算方法：

核心定义 为什么需要它？ 最常见的计算方法

指一个基因的有效转录区域的总长度，通常以碱基对为单位。 在RNA-seq中，更长的基因在随机打断和测序过程中，会有更多片段来自该基因，导致其原始读数更高。直接比较不同基因的counts会误以为长基因表达量更高。 非冗余外显子长度之和：将一个基因的所有外显子（exon）合并，去除重叠部分后计算总长度。

💡 基因长度的不同计算方式

在实际分析中，根据研究目的的不同，"基因长度"有几种常见的定义和计算方法：

  1. 非冗余外显子长度之和：这是最常用和推荐的方法。它计算的是一个基因所有外显子（即编码区和非编码区）合并后的总长度，能最准确地代表该基因转录本的潜在长度。
  2. 非冗余CDS长度之和：只计算编码蛋白的外显子（CDS区）的总长度。如果你特别关注蛋白质的编码潜力，这种方法可能更合适。
  3. 最长转录本长度：对于有多个可变转录本的基因，选择其最长的那个转录本的长度作为该基因的代表长度。
  4. 多个转录本长度的平均值：计算一个基因所有转录本长度的平均值，作为一种折中的方案。

🧬 如何获取基因长度

通常，我们需要从基因注释文件中提取基因长度信息。使用R语言的 GenomicFeatures 包可以方便地完成这项工作。基本步骤如下：

加载必要的包

library(GenomicFeatures)

从GTF或GFF文件创建转录组数据库

txdb <- makeTxDbFromGFF(“your_annotation_file.gtf”, format=“gtf”)

按基因提取所有外显子，并计算每个基因的非冗余外显子总长度

exons_per_gene <- exonsBy(txdb, by = “gene”)
gene_lengths <- sum(width(reduce(exons_per_gene)))

转换为数据框，方便使用

gene_lengths_df <- data.frame(
gene_id = names(gene_lengths),
length = as.numeric(gene_lengths)
)

💻 在表达量标准化中的应用

基因长度最主要的应用场景就是将原始读数转换为TPM或FPKM/RPKM这类标准化表达量。以你之前遇到的TPM计算代码为例：

计算RPK (Reads Per Kilobase)：先对基因长度进行校正

rpk <- count_mat / (gene_lengths / 1000)

计算TPM：再对测序深度进行校正

tpm <- t( t(rpk) / colSums(rpk) ) * 1e6

• 第一步：rpk <- count_mat / (gene_lengths / 1000)。这一步的目的是消除基因长度的影响。将每个基因的原始读数除以其长度（以千碱基为单位），得到"每千碱基的读数"。这样，长基因和短基因就站在了同一起跑线上。

• 第二步：tpm <- t( t(rpk) / colSums(rpk) ) * 1e6。这一步的目的是消除样本间总测序深度（即总读数）的差异。将每个基因的RPK除以该样本所有基因RPK的总和，再乘以100万，得到"每百万转录本数"。这使得每个样本的TPM总和都是100万，便于跨样本比较。

⚠️ 注意事项

• 确保顺序一致：在计算时，务必确保gene_lengths向量中的基因顺序与表达量矩阵中的行名完全一致。

• 使用有效长度：更精确的计算会使用"有效长度"，它会考虑测序片段的长度分布，但通常情况下用上述总外显子长度已足够。

• 注释文件版本：不同来源或版本的注释文件（如UCSC, Ensembl, GENCODE）计算的基因长度可能会有细微差异。

希望这些解释能帮助你更好地理解gene_lengths这个概念及其在数据分析中的重要性！

sample_counts <- rowSums(count_mat)          # 总 counts
gene_lengths  # 如果你有序列长度向量
tpm <- t( t(count_mat) / gene_lengths )      # 每长度
tpm <- tpm / colSums(tpm) * 1e6              # 百万标准化
sample_tpm <- rowMeans(tpm)

计算基因表达量TPM（Transcripts Per Million）值的经典步骤

。下面我为你详细解释每一步的意图、背后的原理，并提供一些注意事项。

📌 TPM计算原理与步骤分解

首先，TPM的计算目标是对基因的表达量进行标准化，使其既考虑不同样本之间的测序深度差异，也考虑基因本身长度差异，从而使得不同基因在不同样本间的表达量具有可比性。

下面的表格清晰地展示了整个计算流程和每一步的核心目的：

步骤 代码 目的解释 数学含义

  1. 计算总Counts sample_counts <- rowSums(count_mat) 计算每个基因在所有样本中的原始读数（Counts）之和。这通常用于观察基因的整体表达水平，但并非TPM计算的必需步骤。 对每行（每个基因）求和

  2. 长度校正 tpm <- t( t(count_mat) / gene_lengths ) 核心步骤1：消除基因长度对表达量的影响。将每个基因的Counts除以其有效长度（例如，非冗余外显子长度之和），得到“每碱基的读数”。 Counts(i,s) / Length(i)

  3. 样本标准化 tpm <- tpm / colSums(tpm) * 1e6 核心步骤2：消除样本间测序深度差异。将每个样本经过长度校正后的值，除以该样本所有基因校正值之和，再乘以100万。使得每个样本的TPM总和为100万。 [Counts(i,s)/Length(i)] / [Σ(Counts(j,s)/Length(j))] * 10^6

  4. 计算平均表达 sample_tpm <- rowMeans(tpm) 后续分析：计算每个基因在多个样本中的平均TPM值，用于比较基因间的相对表达水平。 对每行（每个基因）求均值

💡 关键细节与注意事项

在实际操作中，以下几个细节对结果的准确性至关重要：

  1. 基因长度向量 gene_lengths：这是计算中的关键输入。它的长度必须与 count_mat 矩阵的行数（基因数量）完全一致，并且顺序要一一对应。你需要一个包含每个基因有效长度的向量，其获取方式可以是：
    ◦ 使用 Bioconductor 的注释包（如 TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene），通过计算非冗余外显子长度之和或最长转录本长度来获得。

    ◦ 使用 biomaRt 包 从 Ensembl 数据库在线查询获取。

  2. 矩阵转置操作 t( )：步骤2中的双重转置 t( t(count_mat) / gene_lengths ) 是一个巧妙的技巧。因为R语言中矩阵除以向量的操作是按列进行的。我们的目标是对每一行（每个基因）的Counts除以其对应的长度，所以需要先转置矩阵，让“基因”变成列，进行按列除法后，再转置回来恢复原始维度。

  3. TPM与FPKM/RPKM的区别：TPM和FPKM都是经过长度和测序深度校正的单位，但它们的标准化思路有细微, 但至关重要的差别：
    ◦ FPKM 是先对长度做校正，然后对测序深度做校正。

    ◦ TPM 是先对长度做校正，然后对校正后的总值进行标准化。

    ◦ 结果就是，一个样本中所有基因的TPM值总和始终为100万，这使得TPM在不同样本间的比较更为直观和稳定。因此，TPM现在被更广泛地推荐使用。

🛠️ 主要应用场景

TPM值标准化后，主要用于：
• 比较同一样本内不同基因的表达水平：例如，找出哪个基因在某个细胞或组织里表达最高。

• 比较不同样本间同一基因的表达水平：例如，观察某个基因在疾病组和对照组中的表达差异。

希望这份详细的解释能帮助你透彻理解TPM的计算过程！如果你对获取基因长度或代码实现还有其他疑问，可以随时再问我。

t(t(rpk) / colSums(rpk)) * 1e6 这一行“两次转置”的目的只有一句话：

让 R 把“每个基因在该细胞里的占比”按 列 方向做向量除法，而 R 的 / 默认是 列-wise 操作。

1. 先看清维度

假设

  • rpk：基因 × 细胞 矩阵，维度 G × C
               cell1  cell2  cell3
geneA            10     20     30
geneB            40     50     60
geneC            70     80     90

2. 我们想干什么？

TPM 第 2 步：
把每个细胞内部所有基因的 RPK 加总 → 得到该细胞的 library size（以 RPK 为单位），然后把该细胞里每个基因的 RPK 除以这个总和，再乘 1e6。

也就是

TPM_gc = RPK_gc / (sum_g RPK_g,c) * 1e6

按列做除法。

3. R 的 / 规则

  • 如果 x 是矩阵，y 是向量，那么
    x / y 会把 y 的每个元素对应到 x 的每一列 去做除法（column-wise）。
    维度必须 length(y) == ncol(x)。

但我们现在的矩阵是 G × C，而 colSums(rpk) 长度 = C。
直接写 rpk / colSums(rpk) 会把“每列”除以对应的 colSums，正好是我们想要的列方向除法！

4. 那为什么还要两次转置？

历史原因 / 防呆写法 / 早期代码 copy-paste 习惯。

  • 早期有人担心“如果矩阵是 细胞 × 基因 呢？”
    先 t(rpk) 变成 C × G，此时 colSums() 长度 = G，再 / 就是按基因方向除，不符合 TPM 定义。
    于是再 t() 回来，确保最终维度还是 G × C。

  • 另一种场景：
    如果你手里拿到的是 细胞 × 基因 矩阵，那么

    t(t(rpk) / colSums(rpk))

    就是“先转置成基因×细胞，按列除，再转置回细胞×基因”——通用模板，不管原始维度怎样，写完一定对。

5. 现代写法（更直观）

只要你能 100% 确定 rpk 是 基因 × 细胞，可以直接：

tpm <- rpk / colSums(rpk) * 1e6

一次转置都不需要，结果完全一样。

一句话总结

  • 两次转置 = 通用模板，不管矩阵是“基因×细胞”还是“细胞×基因”都能按 列 完成 TPM 归一化。
  • 如果你已明确维度是 基因×细胞，t(t(...)) 完全可以省掉，直接 rpk / colSums(rpk) * 1e6 即可。
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