生物信息 R语言和python 处理1000多个细胞的高通量单细胞RNA测序数据 10X Genomics标准输出文件 Seurat（R语言）和 Scanpy（Python语言）

。处理1000多个细胞的高通量单细胞RNA测序数据，确实是一个需要系统流程的工作。下面是一个清晰的流程图，帮助你快速把握核心步骤，之后我会对每个环节进行详细说明。
flowchart TD
A[原始FASTQ文件] --> B[序列比对与定量]
B --> C[生成基因表达矩阵]
C --> D[细胞级质控与过滤]
D --> E[数据标准化]
E --> F[批次效应校正]
F --> G[特征选择与降维]
G --> H[细胞聚类与注释]
H --> I[下游分析]

接下来，我们详细讲解每个步骤的关键要点和常用方法。

🧬 从原始数据到表达矩阵

首先，我们需要将测序得到的原始序列与参考基因组进行比对，从而统计出每个基因在每个细胞中的表达量。

• 核心任务：将原始FASTQ文件转换为基因-细胞表达矩阵。在这个矩阵中，行代表基因，列代表细胞，值通常是UMI计数，反映了基因的表达水平。

• 常用工具：对于10X Genomics平台的数据，官方软件 Cell Ranger 是标准选择，它集成了比对、细胞barcode识别和UMI计量的完整流程。STARsolo 是一个更快速、灵活的开源替代方案。此外，基于伪比对算法的 kallisto | bustools 或 Salmon alevin 工具包，在处理大规模数据时速度极快，适合快速探索。

🔍 细胞级质控与过滤

得到初始矩阵后，关键是筛选出高质量的细胞数据进行后续分析，剔除“背景噪音”。

• 识别低质量细胞：重点关注三个核心指标：

1.  每个细胞检测到的基因数（nFeature_RNA）：数值过低可能是空液滴或死细胞；过高则可能是多个细胞被捕获（双联体或多联体）。
2.  每个细胞的UMI总数（nCount_RNA）：与基因数类似，用于评估细胞捕获效率。
3.  线粒体基因占比（percent.mt）：比例过高通常表明细胞处于凋亡或应激状态。

• 设定过滤阈值：例如，可以保留基因数在500-4000之间、线粒体基因比例低于20%的细胞。对于1000多个细胞的数据，需要特别注意双联体的检测，可以使用 DoubletFinder 或 Scrublet 等工具。

⚖️ 数据标准化与批次效应校正

质控后的数据需要进行标准化，以消除技术误差，使不同细胞间的表达量具有可比性。

• 标准化：目的是消除因测序深度不同造成的细胞间总UMI计数的差异。Seurat包中的 LogNormalize 方法（即CPM标准化后取对数）是一种常用方法。对于单细胞数据特有的高噪点和零膨胀特征，sctransform 方法通常表现更佳，它基于负二项回归模型，能同时完成标准化和特征选择。

• 批次效应校正：如果你的数据来自多个批次（如不同实验时间、不同测序仪），必须校正批次效应。常用工具包括 Harmony 和 Seurat 中的 CCA（典型相关分析）整合方法。它们的目标是在保留真实的生物学差异的同时，去除由技术原因引入的差异。

📊 降维、聚类与细胞注释

这是单细胞分析的核心环节，旨在发现细胞群体并识别其类型。

• 特征选择与降维：先筛选出在不同细胞间波动性高（HVG）的基因用于下游分析。然后使用主成分分析（PCA）进行线性降维。再进一步应用 t-SNE 或 UMAP 等非线性降维方法，将细胞在二维或三维空间中可视化，直观展示细胞间的相似性。

• 细胞聚类与注释：基于PCA降维结果，使用图聚类算法（如Louvain算法）将细胞划分为不同的群体（簇）。最后，根据每个细胞簇中高表达的标志基因（marker genes），结合生物学知识，对每个簇进行细胞类型注释（例如，高表达CD3D的簇可能是T细胞）。

➕ 下游分析

完成细胞分型后，你可以进行更深入的挖掘：
• 差异表达分析：比较不同细胞簇或不同处理条件（如疾病 vs 健康）下的基因表达差异，找出关键基因。

• 拟时序分析：使用 Monocle 或 PAGA 等工具推断细胞的分化轨迹，研究细胞状态的动态变化。

• 细胞间通讯分析：通过 CellChat 或 NicheNet 等工具预测不同细胞类型之间的信号相互作用。

💎 简要总结

处理1000多个细胞的高通量数据，关键在于严谨的质控、选择合适的标准化与整合方法，以及合理的生物学注释。最常用的分析工具是 Seurat（R语言）和 Scanpy（Python语言），它们提供了完整的分析流程。

希望这份梳理对你有所帮助！如果你在具体步骤中遇到问题，或者想了解某个环节的更多细节，我们可以继续深入探讨。

R语言 Seurat 是单细胞RNA测序数据分析中最核心、最强大的R包之一

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。为了让你能快速把握其分析流程的全貌，我先把标准流程梳理成下面的图表，它展示了从原始数据到细胞分型和注释的关键步骤✨：
flowchart TD
A[原始数据
（基因x细胞矩阵）] --> B[数据质控与过滤]
B --> C[数据标准化]
C --> D[高变基因筛选]
D --> E[数据缩放]
E --> F[线性降维
（PCA）]
F --> G[细胞聚类]
G --> H[非线性降维
（UMAP/t-SNE）]
H --> I[差异表达分析与
细胞类型注释]
I --> J[最终结果]

下面我们一步步来看每个环节具体怎么做，以及需要注意什么。

🛠️ 准备与数据导入

首先确保已安装并加载必要的R包。
install.packages(c(“Seurat”, “dplyr”, “patchwork”))
library(Seurat)
library(dplyr)
library(patchwork)

对于10X Genomics标准输出文件（通常包含barcodes.tsv.gz, features.tsv.gz, matrix.mtx.gz），使用Read10X函数读取，并用其创建Seurat对象。

读取数据

pbmc.data <- Read10X(data.dir = “path/to/your/data/directory/”)

创建Seurat对象，同时进行初步过滤

pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data,
project = “pbmc3k”,
min.cells = 3, # 滤除在少于3个细胞中表达的基因
min.features = 200) # 滤除检测基因数少于200的细胞

🔍 数据质控（QC）

质控旨在过滤低质量细胞，通常依据三个指标：
• nFeature_RNA：每个细胞中检测到的唯一基因数。过低可能是空液滴或死细胞；过高可能是多重体（多个细胞）。

• nCount_RNA：每个细胞的UMI总数（即该细胞所有基因的读数之和）。

• percent.mt：线粒体基因计数占比。过高通常表明细胞凋亡或状态不佳。

计算线粒体基因比例并可视化QC指标：

计算线粒体基因百分比（人类基因通常以MT-开头）

pbmc[[“percent.mt”]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = “^MT-”)

可视化QC指标（小提琴图）

VlnPlot(pbmc, features = c(“nFeature_RNA”, “nCount_RNA”, “percent.mt”), ncol = 3)

查看基因数与UMI数、线粒体比例的相关性散点图

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = “nCount_RNA”, feature2 = “percent.mt”)
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = “nCount_RNA”, feature2 = “nFeature_RNA”)
plot1 + plot2

根据图表分布设定阈值过滤细胞：
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)

📊 标准化与高变基因筛选

过滤后需对数据进行标准化，以消除细胞间测序深度的差异。
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = “LogNormalize”, scale.factor = 10000)

接下来识别高变基因，这些基因在细胞间表达差异大，蕴含区分不同细胞类型的生物信息。
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = “vst”, nfeatures = 2000)

可视化高变基因，并标记前10个

top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2

在进行降维之前，需要进行数据缩放（Scaling），使每个基因在所有细胞中的表达均值为0，方差为1，赋予每个基因在下游分析中相同的权重。

对所有基因进行缩放（耗时可能较长，下游分析通常仅使用高变基因，也可只缩放高变基因）

all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

📉 降维、聚类与可视化

使用主成分分析进行线性降维，并确定用于聚类的显著主成分数量。

运行PCA

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

评估主成分重要性的方法

方法1：肘部图（Elbow Plot），寻找拐点

ElbowPlot(pbmc)

方法2：JackStraw方法（更耗时但更严格）

pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)

基于选定的主成分（例如前10个），构建细胞邻域图并进行聚类。
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5) # resolution参数影响聚类粒度，值越大簇越多

然后运行UMAP或t-SNE进行非线性降维，以便在二维图上直观观察细胞聚类情况。
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)

pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10) # 也可以选择t-SNE

绘制聚类图

DimPlot(pbmc, reduction = “umap”, label = TRUE)

🔬 差异表达与细胞注释

最后，识别每个细胞簇的特异性表达基因，用于推断细胞类型。

找到簇1的所有标记基因（与其余所有簇比较）

cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)

找到所有簇的标记基因

pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)

查看簇0中表达量前2的标记基因

pbmc.markers %>% filter(cluster == 0) %>% arrange(desc(avg_log2FC)) %>% head(n = 2)

根据已知的细胞标记基因，对聚类进行注释。例如：

为聚类分配新的细胞类型标识

new.cluster.ids <- c(“Naive CD4 T”, “Memory CD4 T”, “CD14+ Mono”, “B”, “CD8 T”, “FCGR3A+ Mono”, “NK”, “DC”, “Platelet”)
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)

绘制注释后的UMAP图

DimPlot(pbmc, reduction = “umap”, label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()

💎 实用建议

• 数据探索：多使用str(pbmc)、pbmc@assays$RNA@counts等命令查看对象结构。

• 参数调整：如聚类resolution、PCA的dims数量需根据具体数据集调整。

• SCTransform：Seurat推荐的新标准化方法SCTransform，可替代NormalizeData, FindVariableFeatures, ScaleData，尤其适用于整合不同批次数据。

希望这份梳理能助你顺利开启单细胞数据分析之旅！如果你在具体操作某一步骤时遇到问题，或者想了解更深入的细节，比如批次效应校正，我们可以继续探讨。

python语言Scanpy（Python语言）

Scanpy 是 Python 中分析单细胞 RNA 测序数据的强大工具，功能与 R 中的 Seurat 包相当。为了让你快速把握 Scanpy 的标准分析流程，我先把核心步骤梳理成下面的图表：
flowchart TD
A[数据读取
sc.read_10x_mtx] --> B[质控与过滤
sc.pp.filter_cells/genes]
B --> C[标准化
sc.pp.normalize_total, sc.pp.log1p]
C --> D[高变基因筛选
sc.pp.highly_variable_genes]
D --> E[降维与可视化
sc.tl.pca, sc.tl.umap]
E --> F[细胞聚类
sc.tl.leiden]
F --> G[差异表达与注释
sc.tl.rank_genes_groups]

下面我们来详细讲解每个步骤的具体操作和关键代码。

🛠️ 数据读取与质控

Scanpy 使用 AnnData 对象来存储单细胞数据，其结构类似于 R 中的 Seurat 对象。
import scanpy as sc
import pandas as pd
import numpy as np

读取 10X Genomics 数据

adata = sc.read_10x_mtx(
“path/to/filtered_feature_bc_matrix/”, # 包含 matrix.mtx.gz, features.tsv.gz, barcodes.tsv.gz 的目录
var_names=‘gene_symbols’, # 使用基因符号作为变量名
cache=True # 缓存以加速后续读取
)
adata.var_names_make_unique() # 确保基因名唯一

计算质控指标

adata.var[‘mt’] = adata.var_names.str.startswith(‘MT-’) # 标记线粒体基因（人类）
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=[‘mt’], percent_top=None, inplace=True)

过滤低质量细胞和基因

过滤线粒体基因比例过高的细胞、表达基因数过少的细胞以及在极少数细胞中表达的基因

adata = adata[adata.obs[‘pct_counts_mt’] < 15, :] # 例如，保留线粒体基因比例低于15%的细胞
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200) # 每个细胞至少检测到200个基因
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3) # 每个基因至少在3个细胞中表达

关键点：
• 线粒体基因标记：根据物种调整前缀，例如小鼠为 ‘mt-’。

• 过滤阈值：需根据具体数据集（如细胞类型、实验质量）灵活调整。可结合小提琴图 (sc.pl.violin) 或散点图 (sc.pl.scatter) 来观察指标分布，辅助设定阈值。

📊 标准化与高变基因筛选

过滤后，需对数据进行标准化，并识别用于下游分析的基因。

标准化：归一化总计数并对数转换

sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4) # 将每个细胞的总计数归一化到10,000
sc.pp.log1p(adata) # 进行 log1p 转换，即 log(1 + x)

识别高变基因

sc.pp.highly_variable_genes(
adata,
flavor=‘seurat’, # 算法选择，可选 ‘seurat’, ‘cell_ranger’, ‘seurat_v3’
n_top_genes=2000, # 选择变异度最高的2000个基因
inplace=True
)
adata = adata[:, adata.var.highly_variable] # 保留高变基因进行后续分析

数据缩放（Z-score标准化，均值为0，方差为1）

sc.pp.scale(adata, max_value=10) # 将极端值截断在±10以内

关键点：
• flavor 参数：seurat_v3 适用于大数据集，但参数设置有所不同。

• 数据缩放：此步骤主要影响某些下游分析的性能，并非所有场景都强制需要。

📉 降维、聚类与可视化

这是发现细胞群体的核心步骤。

主成分分析

sc.tl.pca(adata, svd_solver=‘arpack’)

可通过碎石图 sc.pl.pca_variance_ratio(adata) 观察主成分贡献，决定使用多少PCs

构建邻域图（KNN图）

sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=15, n_pcs=30) # n_pcs 通常选择解释方差拐点处的主成分数

UMAP降维与可视化

sc.tl.umap(adata)
sc.pl.umap(adata, color=[‘CST3’, ‘NKG7’]) # 可用已知标记基因着色

细胞聚类（Leiden算法）

sc.tl.leiden(adata, resolution=0.5) # resolution 参数影响簇的多少，值越大簇越多
sc.pl.umap(adata, color=[‘leiden’]) # 可视化聚类结果

关键点：
• n_pcs：根据PCA碎石图的拐点选择，通常足够解释数据的大部分变异即可。

• resolution：这是关键参数，需要尝试不同值（如0.2, 0.6, 1.0）以获得生物学上合理的聚类数量。

🔬 差异表达与细胞注释

最后，通过差异表达分析来鉴定每个细胞簇的特征基因，并据此注释细胞类型。

寻找每个簇的差异表达基因

sc.tl.rank_genes_groups(adata, ‘leiden’, method=‘wilcoxon’) # 使用Wilcoxon秩和检验

可视化特定簇的标记基因（例如簇0）

sc.pl.rank_genes_groups(adata, groups=[‘0’], n_genes=20)

根据标记基因手动注释细胞类型

这是一个示例，需要根据你的生物学知识和已知的细胞标记基因进行调整

celltype_dict = {
‘0’: ‘T细胞’,
‘1’: ‘B细胞’,
‘2’: ‘单核细胞’,
# … 为每个簇分配细胞类型
}
adata.obs[‘cell_type’] = adata.obs[‘leiden’].map(celltype_dict)
sc.pl.umap(adata, color=‘cell_type’)

关键点：
• 标记基因：注释的准确性高度依赖于正确的细胞类型特异性标记基因。需要查阅领域文献或数据库。

• 自动注释：也可使用如 sc.tl.score_genes 或专用工具（如 scCATCH, SingleR）进行辅助或自动注释。

⚠️ 实用技巧与注意事项

1. 内存管理：Scanpy 在处理超大规模数据（如数十万细胞）时，内存效率通常优于某些R包。但对于极大数据集，仍需注意内存使用，例如可考虑分块处理。

2. 结果保存：处理后的 AnnData 对象可以保存为H5AD格式，便于后续读取和分享。
   adata.write(‘my_processed_single_cell_data.h5ad’)
   adata = sc.read_h5ad(‘my_processed_single_cell_data.h5ad’)

3. 批次校正：如果数据来自多个批次，需要在分析前或分析中进行批次效应校正。Scanpy 支持多种方法，如 sc.pp.combat、BBKNN 或整合工具 Harmony 和 Scanorama。

希望这份指南能帮助你顺利使用 Scanpy 探索单细胞数据！如果你在具体操作中遇到问题，比如某个步骤的参数调整，欢迎随时提出。

在单细胞和空间转录组分析中，除了Seurat，确实存在许多强大且各具特色的替代方法。它们在不同的分析阶段或针对特定问题可能更具优势。为了帮助您快速建立整体印象，下面的表格汇总了这些工具的核心特点和主要应用场景。

方法类别 工具名称 核心技术/特点 主要应用场景

综合分析框架 Scanpy Python生态，与Seurat流程类似，可扩展性强 单细胞RNA-seq标准分析流程（质控、聚类、可视化等）

空间转录组分析 GraphST 图神经网络 + 自监督对比学习，深度融合空间信息 空间聚类、多样本整合、细胞类型去卷积

SpaGCN 图卷积网络，可整合组织切片图像信息 高精度空间区域划分，尤其适合有H&E图像的数据

BayesSpace 贝叶斯统计模型，能提升数据分辨率 适用于10x Visium等低分辨率数据的精细化分析

细胞类型注释 SingleR 通过相关性分析，将细胞与参考数据库细胞类型匹配 快速、准确的自动细胞类型注释

cellAssign 基于已知的细胞类型标记基因集进行注释 在特定已知细胞类型背景下进行约束性注释

数据整合与批次校正 Harmony 在降维空间中对齐细胞，高效处理批次效应 多样本整合，尤其适用于大规模数据集

LIGER 整合性非负矩阵分解，保持数据集的独特特征 多样本整合，在混合批次的同时可能更好保留生物学差异

🔬 深入探索特色工具

以下是一些在特定方面表现突出的工具，值得您重点关注。

1. Scanpy：Python生态的标杆
   Scanpy是Python环境下最主流的单细胞分析工具包，其分析流程与Seurat非常相似，涵盖了从数据预处理、降维聚类到差异表达分析和可视化的全过程。如果您更熟悉Python或项目技术栈基于Python，Scanpy是毋庸置疑的首选 。

2. GraphST：空间转录组分析的利器
   对于空间转录组数据，GraphST代表了一类更前沿的方法。它利用图神经网络和自监督对比学习，能够同时利用基因表达信息和细胞的空间位置信息。这使得它在识别组织内功能区域（空间聚类）、合并多个样本（多样本整合）以及推断细胞亚型分布（细胞类型去卷积）方面，通常比不考虑空间信息的传统方法（如Seurat中的Louvain/Leiden聚类）表现更优 。

3. SingleR：高效准确的细胞注释助手
   细胞类型注释是分析中的关键一步。SingleR是一种非常流行的自动注释工具。它的原理是将你的单细胞数据与一个精心整理的参考数据库（如人类原发性细胞图谱）进行比对，通过计算基因表达的相关性，为每个细胞分配最可能的细胞类型标签。这能大大减少手动注释的工作量和主观性 。

💡 如何选择适合你的工具

面对众多选择，您可以基于以下几点进行决策：

• 分析生态系统：如果您和团队主要使用R语言，Seurat及其生态系统（如用于批次校正的Harmony）是自然的选择。如果主要使用Python，则Scanpy及其周边工具（如Scvi-tools）会更集成。

• 数据类型：

◦   对于普通单细胞RNA-seq数据，Seurat和Scanpy这两个主流框架基本可以满足所有核心分析需求。

◦   对于空间转录组数据，强烈建议使用专门的方法，如GraphST、SpaGCN或BayesSpace，因为它们能利用空间位置信息，得到更生物学上可信的结果 。

• 特定分析任务：如果有明确任务，可以选择更专业的工具。例如，需要整合多个批次样本时，Harmony和LIGER是经过验证的优秀选择 。需要进行快速、自动化的细胞类型注释时，SingleR或cellAssign非常方便 。

⚠️ 注意事项与核心建议

• 工具并非互斥：在实际分析中，经常混合使用不同工具。例如，使用Seurat进行质控和标准化，然后用Harmony校正批次效应，最后用SingleR进行细胞注释，这是一种非常常见的策略。

• 关注方法发展：单细胞数据分析领域发展迅速，新方法和更新层出不穷。建议关注相关领域的预印本网站（如bioRxiv）和GitHub，以获取最新的工具信息。

• 从简单开始：如果您是初学者，从Seurat或Scanpy的官方标准教程开始是最佳路径。在熟悉了基本流程后，再根据具体需求引入更专门的工具。

希望这份梳理能帮助您打开思路，找到最适合您研究需求的工具！如果您能分享一下您具体的研究数据类型（例如，是普通单细胞数据还是空间数据），或许我可以提供更具体的建议。

R语言其他替代方案

明白了！您希望继续使用R语言进行单细胞分析，但想寻找Seurat包的替代方案。以下为您梳理了几个成熟且功能强大的替代工具，它们各有侧重，您可以根据自己的需求和偏好进行选择。

🔄 主要替代方案概览

下表总结了几个主流的R语言单细胞分析替代工具，帮助您快速了解它们的特点。

工具名称 核心特点 / 优势 适用场景

SingleCellExperiment (SCE) 基础容器：Bioconductor生态的核心数据结构，许多高级工具（如scran）都基于它构建。 作为数据基础，适合希望灵活组合不同Bioconductor工具包、进行自定义分析流程的用户。

scran 专精算法：提供一系列高质量、经过优化的专门算法，如更准确的细胞间归一化和标记基因检测。 需要精细算法控制、进行严谨差异表达分析或处理大型数据集的用户。

Cellsnake 一体化流程：基于Seurat和Snakemake的自动化流程工具，提供从原始数据到结果报告的“一键式”分析。 追求分析效率、可重复性，希望快速获得标准分析结果，或需要分析多样本、大批量数据的用户。

🔬 各方案详解与工作流程

1. SingleCellExperiment + scran 组合

这是Bioconductor生态系统中非常经典和灵活的组合。

• 典型工作流程：

1.  创建对象：将计数矩阵加载到SingleCellExperiment对象中。
2.  质控（QC）：使用scater包中的函数添加细胞和基因的质控指标（如线粒体基因比例），并进行过滤。
3.  归一化：使用scran::computeSumFactors()计算大小因子，进行去卷积归一化，尤其擅长处理不同细胞类型间表达量差异大的情况。
4.  降维与聚类：使用scran::buildSNNGraph()基于共享最近邻（SNN）图进行聚类。然后使用scater::runPCA和scater::runUMAP进行降维可视化。
5.  差异表达分析：使用scran::findMarkers()寻找簇间的标记基因。

2. Cellsnake（自动化流程工具）

如果您希望节省手动编写每一步代码的时间，Cellsnake是一个极具吸引力的选择。

• 核心优势：

◦   高度自动化：它集成了Seurat、DoubletFinder、SingleR等多种工具，自动完成从质控、过滤、归一化、聚类到细胞类型注释的完整流程。

◦   可重复性强：基于Snakemake工作流管理器，确保分析过程可重复。

◦   用户友好：通过配置文件即可调整参数，无需深入编写大量R代码。

• 典型工作流程：

1.  准备输入数据（如CellRanger的输出目录）。
2.  编辑一个YAML格式的配置文件，指定基本参数。
3.  在命令行中运行一条命令，如 cellsnake run --config my_config.yaml。
4.  Cellsnake会自动运行并生成包含所有结果（如聚类UMAP图、差异表达表格等）的报告。

💡 如何选择？

• 如果你希望完全控制分析细节，并深入学习单细胞分析的每一步：推荐从 SingleCellExperiment + scran 开始。这是理解底层原理的最佳途径。

• 如果你需要快速、标准地完成分析，或处理大量样本：Cellsnake 是最高效的选择，能极大提升分析效率。

• 如果你正在进行轨迹推断（拟时序分析）等特定分析：Monocle3 是该领域的权威工具，可以与其他流程配合使用。

💎 总结与迁移建议

总的来说，脱离Seurat生态系统后，R语言中仍有非常成熟的选择。SingleCellExperiment 是坚实的数据基础，scran 提供了强大的算法引擎，而 Cellsnake 则提供了现代化的自动化分析体验。

希望这份梳理能帮助您顺利切换到新的分析工具！如果您对某个工具特别感兴趣，或者有更具体的分析目标，我可以提供更详细的入门代码示例。