新型免疫印迹检测伯氏疏螺旋体多样性

莱姆病：利用新型免疫印迹检测法检测加利福尼亚和墨西哥的伯氏疏螺旋体物种多样性

摘要

背景：每年在美国报告超过30万新病例，莱姆病是一个重大的公共卫生问题。伯氏疏螺旋体（Bbss）被认为是北美莱姆病的主要病原体。然而，多种遗传上不同的伯氏疏螺旋体物种，包括广义的伯氏疏螺旋体（Bbsl）复合体以及回归热伯氏疏螺旋体（RFB）群，均能够引起蜱传疾病。我们报告了一项使用新型免疫印迹技术对加利福尼亚和墨西哥地区先前未检测到的Bbsl和RFB物种进行血清学调查的初步结果。
方法：如前所述，采用基于重组伯氏疏螺旋体膜蛋白的免疫印迹法检测血清样本对特定Bbsl和RFB物种的血清反应性。若样本对某一特定伯氏疏螺旋体物种的至少两种蛋白表现出免疫球蛋白M（IgM）和/或IgG反应性，则记录为血清阳性。
结果：患者队列包括90名居住在加利福尼亚或墨西哥、符合慢性莱姆病临床病例定义的患者。免疫印迹检测显示，42名患者对Bbsl呈血清阳性（第1组），而56名患者对RFB呈血清阳性（第2组）。8名患者对Bbsl和RFB物种均呈血清阳性。第1组包括对Bbss（14例）、B. californiensis（8例）、B. spielmanii（10例）、B. afzelii/B. garinii（10例）呈血清阳性的患者，以及包含B. mayonii的混合感染患者（3例）。第2组包括对B. hermsii（9例）、B. miyamotoi（7例）、B. turicatae（9例）和B. turcica（2例）呈血清阳性的患者。在其余的第1组和第2组患者中，无法通过免疫印迹技术确定确切的伯氏疏螺旋体物种。
结论：在加利福尼亚和墨西哥，莱姆病与一组多样化的伯氏疏螺旋体物种相关。目前莱姆病的检测主要集中于Bbss的检测上，可能导致漏诊，并且无法及时给予适当的抗生素治疗。未来的莱姆病检测开发必须考虑伯氏疏螺旋体螺旋体的遗传多样性。

关键词 ：莱姆病；Borrelia burgdorferi；回归热Borrelia；Borrelia miyamotoi；蜱传疾病；免疫印迹

1. 引言

伯氏疏螺旋体螺旋体是全球范围内导致疾病的重要原因。伯氏疏螺旋体物种属于螺旋体科（Spirochaetaceae），其特征为革兰阴性、螺旋形细菌，通过周质轴丝[1–3]运动。目前，已知至少有53种伯氏疏螺旋体物种，分为三组：其中约22种属于莱姆病组（B. burgdorferi sensu lato, Bbsl），以及大约29种属于回归热伯氏疏螺旋体（RFB）组。这两个组分别包含莱姆病（LD）和回归热（RF）的病原体[4–6]。其余物种属于第三个遗传上不同的组，这些物种尚未分类，主要与爬行动物相关[4,5,7]。

Bbsl类群包含遗传多样性丰富的细菌，主要分布于北半球，通过硬蜱科（硬蜱）传播[6,8]。在美利坚合众国（美国），莱姆病目前是最大的虫媒传染病，可引起一系列症状，包括肌肉骨骼、神经精神和心脏问题，在极少数情况下甚至导致死亡[9,10]。在北美洲已鉴定出至少11种Bbsl基因种，包括Bbss、B. americana、B. andersoni、B. bissettii、B. californiensis、B. carolinensis、B. garinii、B. kurtenbachii、B. laneii、B. mayonii和B. spielmanii[6,11]。

RFB复合螺旋体同样具有显著的遗传多样性，但主要由软蜱科（软蜱）和人体虱传播[12,13]。它们广泛分布于世界大部分地区，是七大洲中五个洲的重要致病原因[12,13]。RFB在美国西部、加拿大西南部、墨西哥部分地区、中美洲和南美洲、地中海地区、亚洲大部分地区以及整个非洲呈地方性流行[12]。尽管非洲大陆内RFB的生态学和流行病学已被充分了解，但在非洲以外地区的分布情况仍不甚清楚[13]。已有多项报告指出多种RFB物种可引起人类疾病，其中两种物种与高死亡率相关：B. duttonii，存在于东非；以及B. recurrentis，广泛分布于包括非洲、南美洲、欧洲和亚洲在内的世界大部分地区[12]。在北美洲，最常报告的物种是B. hermsii和B. turicatae[12]。

RFB感染应被视为一个重大的公共卫生问题。感染RFB的个体可能出现流感样症状，如反复发热、关节痛、肌痛、头痛和恶心，以及更严重的症状，例如中枢神经系统受累[14,15]。据称，感染某些RFB物种（如B. miyamotoi）的患者比感染Bbsl的患者表现出更明显的症状[14]。各种RFB螺旋体在血液中的播散速度据称比Bbsl物种快100到1000倍，导致较高的发病率和死亡率[10,16,17]。与其他许多螺旋体感染类似，及时进行抗生素治疗可改善RFB感染的临床结果，尽管治疗有时可能引发严重的雅里希‐赫克斯海默反应[18]。

由媒介传播的病原体（包括Bbsl和回归热螺旋体种）引起的症状并不特异，感染Bbsl或RFB的患者也可能同时感染其他媒介传播的病原体，例如巴贝斯虫、埃立克体、无形体、立克次体或巴尔通体，导致症状重叠，无法根据个体病原体进行区分[19]。莱姆病病例的诊断和报告依赖于对伯氏疏螺旋体（Bb）感染敏感性较低的血清学检测，且未能考虑可引起莱姆病及类莱姆病症状的螺旋体的遗传多样性[1,20–22]。尽管针对回归热感染诊断和治疗的研究范围有限，但最近一项初步研究表明，在加利福尼亚，针对Bbsl和RFB的血清反应性可能广泛存在，从而加剧了该州莱姆病诊断的复杂性[15]。

为了评估检测局限性的影响，并确定加利福尼亚和墨西哥地区人群对Bbsl和RFB物种的暴露水平，我们采用了一种recently developed改良型Western blot方法，称为线性免疫印迹，该方法使用来自Bbsl和RFB类群常见菌株和物种的重组抗原，用于莱姆病（LD）和回归热（RF）的血清学诊断[1,2]。测试于2019年为期八个月的时间内对疑似蜱传疾病的患者进行。我们的研究结果证实，美国和墨西哥螺旋体暴露的血清型构成似乎比此前所公认的更为复杂。

2. 材料与方法

2.1. 患者和数据收集

我们的患者队列来自位于美国加利福尼亚州旧金山的医疗机构，该机构专门从事蜱传疾病的诊断和治疗。华盛顿州普亚卢普的西方机构审查委员会（WIRB）批准了匿名回顾性数据收集方案和知情同意书（IRB批准号#1148461）。任何性别的患者，只要年满18岁，有肌肉骨骼、神经精神和/或心脏症状符合莱姆病的病史，并签署书面知情同意书同意数据收集，即可符合本研究的资格。如果受试者符合未经治疗或既往治疗过的慢性莱姆病病例定义，且症状持续超过六个月（具体定义见其他文献）[23,24]，则被纳入本研究。由于使用血清学检测来识别暴露情况而非活动性感染，因此患者参与研究并不需要有明确的蜱叮咬史或游走性红斑皮疹。去标识化的患者样本根据患者的居住地进行编码。血液在独立实验室（包括BioReference®、LabCorp®和AnyLabTestNow®）采集并分离血清，血清样本随后被送往参考实验室进行免疫印迹检测（见下文）。

共获得175份预计对Bbsl和RFB呈阴性的人血清，来源包括疾病控制与预防中心（CDC）、美国病理学家学会、纽约州卫生部、纽约生物制品公司（美国纽约州南安普顿）以及IGeneX参考实验室（美国加利福尼亚州米尔皮塔斯）。IGeneX的样本为进行蜱传疾病常规检测后剩余的血清，原本将被丢弃。对照血清的检测由实验室人员以盲法方式进行，检测流程与Bbsl和RFB患者的临床样本相同。对照血清用于评估免疫印迹的特异性和敏感性，并非作为样本队列的人群对照。

2.2. 抗原制备

通过将杂合基因构建体或基因片段克隆到pET载体中，在Escherichia coli（美国新泽西州皮斯卡特维的GenScript公司）中表达基因产物，然后隔离出纯度达>90%的蛋白质，从而获得重组靶蛋白，如前所述[1,2]。Bbsl重组蛋白来源于多种美国和欧洲的Bbsl物种，包括Bbss菌株B‐31和297，用于检测以下靶标：P18、P23（OspC）、P28、P30、P31（OspA）、P34（OspB）、P39（BmpA）、P41、P45、P58、P66、P93、伯氏疏螺旋体可变表面抗原（VlsE）以及C6（一种包含不同Bbsl物种VlsE免疫优势区域的杂合蛋白），如前所述[1]。所针对的Bbsl物种为Bbss（B‐31和297）、B. californiensis、B.spielmanii、B.afzelii/B.garinii、B.mayonii和B. valaisiana。来自不同RFB物种的重组蛋白用于检测四种靶抗原BipA、GlpQ、fHbp和FlaB，如前所述[2]。所针对的RFB物种为B. hermsii、B. miyamotoi、B. turicatae和B. turcica。

2.3. 抗原条带的制备

Bbsl和RFB免疫印迹的抗原条带制备方法如前所述[1,2]。简而言之，将纯化蛋白和对照蛋白稀释（7–19 纳克蛋白/条）后，使用BioDot液体分配器（BioDot，美国加利福尼亚州尔湾）喷涂在硝酸纤维素膜（Amersham Protran，GE Healthcare生命科学）上形成直线。蛋白L（Sigma，美国密苏里州圣路易斯）以及混合的人免疫球蛋白M（IgM）和IgG（Sigma，美国密苏里州圣路易斯）用作对照蛋白，以检测人血清的添加以及碱性磷酸酶偶联的抗人抗体的添加。随后用5%脱脂奶粉封闭膜，并切成3毫米宽的条带。

2.4. 抗体反应性检测

血清学免疫印迹检测在IGeneX参考实验室进行，该实验室是一家具有临床实验室改进修正案（CLIA）认证的高复杂性检测机构。

测试血清中伯氏疏螺旋体特异性抗体与免疫印迹膜上的伯氏疏螺旋体抗原之间的反应性检测方法如前所述[1,2]。简言之，将膜条标记后，在槽中用稀释液（100 mM Tris、0.9% NaCl、0.1% Tween‐20和1%脱脂奶粉）浸泡5分钟；然后向膜条上加入10‐µL的测试或对照血清。含血清的膜条在室温下孵育一小时，用洗涤缓冲液（KPL，盖瑟斯堡，马里兰州，美国）在室温下洗涤三次，并吸去最后一次的洗液。为了检测IgG和IgM反应性，膜条分别与1:10,000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG或1:6,000稀释的IgM（KPL，盖瑟斯堡，马里兰州，美国）在室温下孵育一小时，然后洗涤三次。

为了显色抗体/抗原反应条带，将膜条与显色底物5‐溴‐4‐氯‐3‐吲哚基磷酸‐硝基蓝四唑（BCIP/NBT，KPL，盖瑟斯堡，马里兰州，美国）反应，在校准对照在39 kDa处出现可见条带后，用蒸馏水洗涤终止反应。条带强度低于校准对照的判为阴性。使用确诊伯氏疏螺旋体感染患者的人血清作为阳性对照，未感染个体的血清作为阴性对照。所有患者样本的免疫印迹检测均同时进行阳性和阴性对照血清样本的检测。

2.5. Bbsl免疫印迹评分

对于Bbsl免疫印迹，以下条带（单位为kDa）用于评估IgG反应性：18、23（OspC）、28、30、31（OspA）、34（OspB）、39（BmpA）、41（FlaB）、45、58、66和93。以下条带（单位为kDa）用于评估IgM反应性：23（OspC）、31（Osp A）、34（Osp B）、39（BmpA）、41（FlaB）和93。免疫印迹结果的判读依据两种不同标准：CDC标准和内部标准，如前所述[1]。根据CDC标准，若23、39和41 kDa这三个抗原条带中有两个呈阳性，则判定IgM反应性为阳性；若18、23、28、30、39、41、45、58、66和93 kDa这十个抗原条带中有五个呈阳性，则判定IgG反应性为阳性。根据内部标准，若23、31、39和41 kDa这四个条带中至少出现两个，则认为IgM反应性为阳性；若23、31、34、39、41和93 kDa这六个条带中至少出现两个，则认为IgG反应性为阳性。

对于RFB免疫印迹，检测到针对FlaB的IgG或IgM抗体，以及BipA、GlpQ和fHbp这三种抗原中任意两种的IgG或IgM抗体，对RFB物种具有最佳特异性。针对每种抗原类型的任一蛋白检测到IgM或IgG抗体均被视为该抗原类型的阳性反应。采用相同的IgM或IgG抗体反应性标准来检测四种RFB抗原，可达到最佳检测敏感性，如先前所述[2]。代表性患者血清样本中Bbsl和RFB的免疫印迹反应性见图A1和A2（附录A）。

3. 结果

我们的队列包括90名符合慢性莱姆病（CLD）临床病例定义的患者，如最近所述[24]。其中77名患者居住在加利福尼亚州，13名患者居住在墨西哥。免疫印迹检测显示，我们队列中所有90名疑似莱姆病患者的伯氏疏螺旋体血清阳性；共有42名患者（47%）对Bbsl（第1组）血清阳性，56名患者（62%）对RFB（第2组）血清阳性。34名患者（38%）仅对Bbsl血清阳性，48名患者（53%）仅对RFB血清阳性，8名患者（9%）对Bbsl和RFB均呈阳性。这些受试者的检测结果按居住地、伯氏疏螺旋体物种的血清反应性以及IgM/IgG反应性总结于表A1（附录A）中。

第1组包括对Bbss（14例）、B. californiensis（8例）、B. spielmanii（10例）、阿夫泽琉斯疏螺旋体/加里尼疏螺旋体（10例）血清反应阳性的患者，以及包含B. mayonii的混合感染患者（3例）。第2组包括对B. hermsii（9例）、B. miyamotoi（7例）、B. turicatae（9例）和B. turcica（2例）血清反应阳性的患者。第1组和第2组的血清反应性结果总结于表A2（附录A）。第1组中4名患者的血清对两种或以上Bbsl物种呈血清阳性，而第2组中2名患者的血清对两种RFB物种呈血清阳性。使用免疫印迹技术无法确定其余第1组和第2组患者所针对的确切伯氏疏螺旋体物种。

如表A1（附录A）所示，Bbsl组的42名患者中有14名（33%）基于与来自B‐31和/或297菌株的Bbss特异性抗原的反应性而具有针对Bbss的抗体。其中4名仅对Bbss有抗体，其余10名患者则对Bbss和其他Bbsl物种均有反应。在五个样本（8、12、51、86和88）中，包括Bbss在内的多种物种的信号强度较强。而在其余五个样本（22、31、52、63和64）中，其他物种的信号远强于Bbss。

使用预期对Bbsl和RFB呈阴性的175份对照血清获得的结果显示，Bbsl免疫印迹的假阳性率为2.3%（4/175份样本），RFB免疫印迹的假阳性率为2.9%（5/175份样本）（表A3，附录A）。Bbsl的假阳性结果出现在一份健康地方性血清（一个对照）、病毒感染（一个对照）和梅毒（两个对照）中。RFB的假阳性结果出现在一份过敏患者血清（一个对照）、多发性硬化症（一个对照）、病毒感染（一个对照）和梅毒（两个对照）中。

4. 讨论

使用新型免疫印迹检测，我们对居住在加利福尼亚和墨西哥且符合慢性莱姆病病例定义的患者进行的初步研究表明，所有患者均暴露于伯氏疏螺旋体（Bb）或回归热螺旋体种（RFB）。阳性免疫印迹进一步在种水平上对以下Bbsl进行了表征：Bbss、B. californiensis, B. spielmanii, 阿夫泽琉斯疏螺旋体/加里尼疏螺旋体以及B. mayonii；并对以下RFB在种水平上进行了表征：B. hermsii, B. miyamotoi, B. turicatae以及B. turcica。大多数血清仅对疏螺旋体种（38%）或仅对回归热螺旋体种（53%）呈反应性，同时对疏螺旋体种和回归热螺旋体种呈血清阳性的较少（9%）。缺乏广泛的双重反应性表明，在我们的免疫印迹中，回归热螺旋体种与疏螺旋体种之间的交叉反应可能性较小。对照血清的免疫印迹检测显示，Bbsl检测的特异性为97.7%，RFB检测的特异性为97.1%（附录A的表A3）。此外，我们的数据表明，在加利福尼亚和墨西哥，暴露于回归热螺旋体种的情况似乎比暴露于疏螺旋体种更为常见，该分布情况与已发表的分布图一致[13]。

属于Bbsl复合体的螺旋体在全球范围内分布，大多数莱姆病病例报告来自美国、欧洲和亚洲[8,25]。美国疾病控制与预防中心（CDC）指出，根据采用两步法伯氏疏螺旋体检测的监测标准，美国每年报告约3万例莱姆病病例；然而，通过其他方法追踪发现，估计美国每年有超过30万人患上莱姆病[26,27]。这一事实表明，采用两步法伯氏疏螺旋体检测的CDC监测标准所捕获的病例数不到实际数量的十分之一，说明莱姆病存在严重漏报现象，而我们的研究结果提示，一些疑似莱姆病但不符合监测标准的患者可能感染了Bbsl或RFB，这些病原体在两步法检测中不与Bbss发生交叉反应。

本研究中使用的免疫印迹检测能够将Bbsl区分为六类：Bbss、B. californiensis、B. spielmanii、B. mayonii、欧洲种B.afzelii/B.garinii，以及未分化的Bb spp。根据美国的监测报告，Bbss的分布模式表现为在全美50个州均有病例报告，其中大多数病例集中在东北部、中西部北部和北加利福尼亚[26,27]。然而，其他Bbsl物种在美国无法通过商业检测被发现。直到最近，Bbss、B. garinii和B. afzelii被认为是莱姆病的唯一致病因子。目前认为有九个物种具有致病潜力：B. afzelii、B. bavariensis、B. bissettii、Bbss、B. garinii、B. kurtenbachii、B. lusitaniae、B. spielmanii和B. valaisiana[28]。另外九个物种，包括B. californiensis，尚未从人类中分离出来。B. afzelii、B. garinii和B. spielmanii被认为是主要存在于欧亚大陆的伯氏疏螺旋体物种，而B. californiensis则被认为是北美美洲种[28]。我们对伯氏疏螺旋体物种致病性的认识正在不断深入，一些原本未从人体分离且被认为不具致病性的物种，也可能具有致病能力。

本研究中使用的免疫印迹检测能够将RFB分为五类：B. hermsii、B. miyamotoi、B. turicatae、B. turcica和未分化的RFB spp.。回归热螺旋体种在全球范围内存在，是发病率和死亡率的重要原因，特别是在贫困非洲国家[13]。由B. crocidurae引起的回归热最近被报告为塞内加尔人群中最常见的蜱传感染，在206例发热患者的队列中，13%的患者血样中检测到可识别的B. crocidurae DNA[29]。在摩洛哥西北部，B. hispanica感染被认为导致了超过20%的不明原因发热病例[30]。尽管非洲地区回归热螺旋体种的生态学和流行病学已有较详细的描述[13]，但分子检测技术的进步使得在人类样本中广泛鉴定出伯氏疏螺旋体种，从而对回归热感染的地理分布和流行情况的传统认知提出了挑战[15]。例如，最近一项研究报道，在俄罗斯301例确诊为伯氏疏螺旋体感染的患者队列中，约23%的患者分子检测显示为B. miyamotoi阳性[31]。RFB在美国西部、中美洲和南美洲也日益引起关注[13,32]。

回归热在美国不属于全国法定报告疾病，且尚无标准病例定义[33]。2011年，回归热在12个西部州属于可报告疾病，共报告504例，其中70%的病例来自三个州：加利福尼亚（33%）、华盛顿州（25%）和科罗拉多州（11%）[17,33]。在美国，大多数人类回归热病例发生在西部各州，致病物种包括B. miyamotoi, B. hermsii、B. lonestari、B. parkeri、B. turicatae和B. mazzotii[4,5,17,33–38]。美国大多数病例由B. hermsii引起，该病原体通过Ornithodoros hermsi蜱传播，这些蜱通常生活在海拔1500至8000英尺针叶林中的鼠类巢穴内[17,33]。这些软蜱为夜间快速吸血者，常在人类睡眠时叮咬而难以被察觉[16,17]。在加利福尼亚，已报告了B. miyamotoi、B. hermsii和B. parkeri的人类感染病例[32]，并在蜱中检测到B. coriaceae，但尚未确认其导致人类感染[32,39]。B. miyamotoi最初于1995年在日本被发现，但据认为最近才传入西半球[38,40]；在美国，已在北美硬蜱I. scapularis和I. pacificus中检测到该病原体[35,38,41,42]。

伯氏疏螺旋体螺旋体的遗传多样性，以及由这些多样化的病原体引起的感染症状的多样性，使得诊断与伯氏疏螺旋体相关的疾病变得具有挑战性[15,43]。需要认识到，分类是人类的概念，而属于伯氏疏螺旋体属的生物体实际上处于一个连续的谱系中，而非明确划分的、易于归类的遗传上distinct的群体。一些在基因上属于RFB群的物种，例如B. miyamotoi和B. lonestari，其传播媒介为硬蜱而非软蜱，因此有人提议将其归入一个新的类别——硬蜱传播的回归热（HTBRF）[4,13,38,42,44]。B.miyamotoi在不同地理区域和不同传播媒介中表现出遗传差异，由此提出了将其划分为B. miyamotoi sensu lato复合体的建议[14,35,45–50]。

此外，两种新近描述的、致病性未知的伯氏疏螺旋体物种B. turcica和B.tachyglossi由与Bbsl相同的硬蜱传播，但在遗传上它们更接近回归热群（RFB）复合体的螺旋体。这两种RFB类群的基因组还含有与Bbsl特异性基因同源的基因，因此这些生物体显示出Bbsl与RFB伯氏疏螺旋体类群之间的表型联系[51]。为了进一步增加分类的复杂性，最近有人提议将Bbsl划入新属博雷利菌属；然而，由于Bbsl类群与RFB类群具有传染性和生物学相似性——两者均为可导致人类和动物疾病的细菌性人畜共患病，均由吸血节肢动物传播，并且在显微镜下几乎完全相同——因此将已确立的伯氏疏螺旋体属拆分可能会在医学、科学和公众群体中引起混淆，目前仍存在争议[52,53]。

另一个有争议的问题是蜱虫将伯氏疏螺旋体（Bb）物种传染给人类所需的传播时间。尽管较早的动物模型表明，Bbss的传播需要24–48小时的蜱虫吸血，但近期对Bbsl感染的研究对此教条提出了挑战[54–58]。此外，在动物模型和人类中，RFB的传播可能显著快于Bbsl，仅需数秒至数小时即可完成传播[59–61]。因此，由于RFB从蜱虫向人类传播的速度更快，可能对人群造成更高的感染风险。

最近提出了一种慢性莱姆病的病例定义，该定义包括了伯氏疏螺旋体螺旋体复合体的所有成员，涵盖莱姆病和RFB类群[24]。由于伯氏疏螺旋体属在遗传相关生物体中构成了一个连续谱，包含伯氏疏螺旋体（Bb）和RFB类群，并且在生态学上存在重叠，同时引起一系列相似的临床表现，因此采用斯特里克和费斯勒提出的定义，将RFB与Bbsl一同归类为莱姆病的致病因子，是一种合乎逻辑的方法。正如本研究中所展示的，由于伯氏疏螺旋体的抗原表达具有变异性，且存在物种分布的重叠，在当前有限的检测能力下，Bbsl与RFB之间的临床区分可能较为困难。因此，将所有伯氏疏螺旋体物种都包括在内的更广泛的莱姆病定义是合理的。

这项研究凸显了迫切需要一种能够正视伯氏疏螺旋体螺旋体的复杂性和遗传多样性的诊断方法。美国疾病控制与预防中心（CDC）推荐的市售血清学检测试剂盒对Bbss具有高度特异性，但敏感性较差[1,20–22,62]。美国疾病控制与预防中心对莱姆病的病例定义范围狭窄，且被认定为阳性病例所需的实验室标准十分严格[63]。商业化的血清学检测仅基于单一Bbss菌株B‐31的抗原，因此该检测方案无法检测到缺乏与B‐31交叉反应的伯氏疏螺旋体物种和菌株的抗体反应性——这一局限性导致许多伯氏疏螺旋体病原体无法被检出[1,15,43]。

伯氏疏螺旋体（Bb）和RFB免疫印迹具有独特的条带模式，因此基于伯氏疏螺旋体（Bb）抗原的血清学检测无法充分检测RFB抗原[1,15,43]。对Borrelia螺旋体的检测应理想地涵盖所有种类的生物体，包括Bbsl和RFB。目前仅有少数国家级参考实验室、学术实验室或专业实验室可通过显微镜检查和分子检测提供RFB检测，而使用“自建”方法进行RFB血清学检测的实验室也极少[13,15,38,43]。显微镜检查具有非特异性；仅当血液中细菌载量较高时才能观察到螺旋体[13,15,43]，并且诸如假螺旋体（源自红细胞的丝状物）之类的伪影可能被误认为是螺旋体[15,64]。理想情况下，显微镜诊断应通过其他方法（如血清学检测）进行确认。遗憾的是，由于商业可获得的RFB试剂盒尚不可用，RFB感染仅被零星检出，导致对人类暴露于RFB物种的地理分布缺乏了解[15]。相比之下，本报告中描述的免疫印迹检测在我们的初步研究中检测到了对多种Bbsl和RFB物种的暴露。

抗Bb血清阳性患者和抗RFB血清阳性患者的IgM阳性频率往往高于IgG阳性或IgM/IgG双阳性。在患有晚期或慢性莱姆病的患者中，已证实存在持续性IgM反应性[65–67]。此外，在接受抗生素治疗后仍存在持续性Bb感染的人类受试者中也检测到IgM反应性[67,68]。我们的队列符合CLD的病例描述，并表现出与莱姆病及其他蜱传共感染一致的症状，如肌肉骨骼、神经精神和/或心脏表现。最近的研究显示，晚期RFB感染患者也会出现持续性IgM血清反应性[15]。本研究证实了先前的研究结果，即持续性IgM血清反应性与Bb和RFB感染均有关联，并提示这些感染可能具有持续性。在设计用于诊断的检测方案时，应认识到 这一事实。

总之，加利福尼亚和墨西哥存在Bbsl和RFB的暴露问题，令人担忧。Bbsl和RFB感染可能解释那些对Bbss血清学检测呈阴性患者的莱姆病症状。一些患者可能同时暴露于Bb和RFB物种，进一步增加了诊断和治疗的复杂性。针对Bbsl和RFB的免疫印迹检测能够检测出多样化的伯氏疏螺旋体血清型，并将促进对加利福尼亚和墨西哥地区人类暴露于致病性伯氏疏螺旋体的更好理解。