AlphaFold实用指南—官网教程1

本篇博客主要是我参与学习EMBL-EBI关于AlphaFold培训课程的一些笔记，

官网相关教程信息，参考：https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/alphafold/

这个教程适合什么样的人去阅读学习：

以及你期望能够从中学到什么：

一，预备知识

1，术语表：

https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/alphafold/glossary-of-terms/

2，第一性原理：Anfinsen’s dogma

安芬森法则：蛋白质结构的“序列决定论”。

其关键价值在于为蛋白质结构预测提供了理论基础 —— 既然序列是结构的唯一 “密码”，理论上就可通过序列反推结构。

3，构象搜索悖论：Levinthal’s paradox

蛋白质链理论上可采取的构象数量极其庞大（如一个含 100 个氨基酸的蛋白，构象数可达10^30以上）。若蛋白质通过 “逐一尝试所有构象” 的方式寻找天然结构，所需时间将远超宇宙寿命（约1.38×10^10年），这与现实中蛋白质能在毫秒至分钟内完成折叠的事实形成矛盾，即 “莱文塔尔悖论” 。

其本质是揭示了 “全遍历构象” 的不可能性，倒逼科学界思考蛋白质折叠的高效路径（而非随机搜索，说到随机搜索，其实我们都会直接想到进化算法、遗传算法之类的实现）。

悖论在于探索构象需要的时间非常长，也就是folding process是一个非常hard的问题，但是也许我们可以避开folding process直接预测folding result。

4，结果和过程并不矛盾

为何安芬森法则与莱文塔尔悖论并不矛盾？

二者看似冲突（前者说“序列决定结构”，后者说“构象太多无法搜索”），实则针对蛋白质折叠的不同维度，核心矛盾可通过“目标与路径的分离”化解：

1. 关注对象不同：安芬森法则聚焦“结果”——蛋白质的最终天然结构由序列决定，不涉及“如何达到该结构”的过程；莱文塔尔悖论聚焦“过程”——若通过随机搜索构象的方式达到天然结构，会面临时间困境。二者分别回答“结构由什么决定”和“如何高效形成结构”，不存在逻辑冲突 。
2. AI预测的实现其实在实践上进一步验证了“无矛盾性”：现代AI（如AlphaFold）通过学习大量已知的“序列-结构”对应关系，可直接预测蛋白质的最终三维结构，无需模拟折叠过程——这正是安芬森法则的实践体现（序列→结构），同时也避开了莱文塔尔悖论的“过程困境”（无需遍历构象） 。
3. 理论与现实的统一：安芬森法则为结构预测提供了“可行性”（序列含结构信息），莱文塔尔悖论则指出“直接遍历构象不可行”，二者共同推动了对“高效折叠路径”的研究（如能量漏斗模型、分子伴侣机制），最终形成“序列决定结构，高效路径实现结构”的完整逻辑 。

综上，安芬森法则与莱文塔尔悖论并非对立关系，而是从“结果”与“过程”两个维度共同揭示蛋白质折叠的规律：前者确立了“序列→结构”的理论基础，后者则倒逼科学界探索高效折叠路径，二者共同推动了蛋白质结构预测（尤其是AI预测）的发展。

5，3个数字：2020，CASP14，Alphafold2

6，如何访问

alphafold3网页服务器：https://alphafoldserver.com/

colabfold（让每一个实验室都能够做结构预测）https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb#scrollTo=kOblAo-xetgx

现成的alphafold数据库：https://alphafold.ebi.ac.uk/

7，机器学习的角度：理解Alphafold能做什么不能做什么？

下面这个例子其实就是动态/生理建模，通过RMSD误差的评估其实我们可以看到差异所在：

二，验证与影响

这一节开始单独与预备知识抽离出来，是因为这一节开始就是实践应用的人应该重点考虑的相关因素了。

1，AlphaFold2 的蛋白质结构预测是如何得到验证的？

CASP15 alphafold系并没有参加，但是当时alphafold已经开源了。

结构生物学的后续证据

其中溶液和结晶是从机器学习的角度来看的，毕竟如果假设这是两个蛋白质构象的数据分布，那么只在结晶数据PDB上训练的model是不是会有分布bias偏差？

其实这一点一直被人argue，也基本上是个搞机器学习的都会问这个傻二愣问题，但是这个现象其实早就有研究解释了。（所以，下一次，如果你科普alphafold模型，或者是做类似model的汇报，再有人问你训练数据是结晶巴拉巴拉，会不会有bias的时候，你直接用文献报道回怼回去，我见到过不少做湿实验的老师问过这个问题，总感觉还活在上一个世纪一样）。

2，AlphaFold 2 的结构预测有多准确？

前面是讲RMSD指标用来评估测得准不准，后面就是举几个例子说明哪些是通常测不准的：

侧链、IDR无序区域、结构域之间的柔性连接体linker、跨膜蛋白

3，科学家如何使用 AlphaFold 2？或者说，科研使用AlphaFold2的正确姿势是怎么样的？

Structural biology 结构生物学干湿并行

使用 AlphaFold2 结构预测指导分子和细胞生物学

蛋白质工程与设计

三，输入与输出

重点是理解下面这些指标：

1，多序列比对MSA的作用

2，成对表示的作用

3，如何获取最终的结构？

4，使用置信度分数评估 AlphaFold2 预测的结构

部分可以参考我之前的博客：https://blog.youkuaiyun.com/weixin_62528784/article/details/144540998?spm=1001.2014.3001.5502

但是这篇博客基本上是一些二手信息解读，其实并不是很准确，所以还是以本篇博客为主，是一手信息。

pLDDT：理解局部置信度

局部距离差异测试，参考：https://academic.oup.com/bioinformatics/article/29/21/2722/195896?login=true

现在我们获取的网页服务器预测结果，一般对于pLDDT的测试效果如下：

基本上看青色、蓝色就可以了。

以及还是老问题，对于IDR也就是内在无序区域的序列部分：

最后还是要说明，所谓高置信度还是局限在局部指标下，比如说结构域局部置信度高，那么涉及到局部的好说，但是结构域与另外一个高置信度结构域之间的相对位置，这个指标其实是跨结构域的，也就是非局部指标，

非局部scale，不好拿过来评测。

几个预测实例：

PAE：AlphaFold2 预测的全局置信度度量

前面说了，pLDDT是局部置信度指标，只能够拿来分析以及查看局部的结构是否预测可靠，涉及到跨局部的指标、特征以及其他结论，都不能够直接推导。

而PAE，就是在全局层面进行描述的一个置信度指标，

比如说下面结构预测的PAE图，就有两个深绿色的矩形区域，以及其他两个浅绿色的矩形区域；

这个图怎么来看：在y轴处画一条横线，也就是预测结构和实际结构在这条横线上的y残基处对齐重叠，这个时候x轴残基处两个结构之间（预测和实际）会有一个距离，也就是有一个差异值，这个差异值有一个分布，取均值就是PAE值，我们在（x，y）处将这个PAE值映射/压缩成一个颜色色深的数值，比如说是浅绿色还是深绿色。

所以，从定义我们其实可以看到，这个指标是用来描述一个残基对（x，y）的相对距离的置信度指标，

这么来讲吧，如果我预测的结构中（1,727）也就是第1位和第727位的残基，如果我在727位置上将预测的结构和真实的结构对齐重叠了，如果这个时候第1位的残基也是重叠的，也就是PAE的预期值是0，那不就正好说明1、727这两个残基之间的位置正好被我的model预测准确了吗，因为我建模中这两个残基的位置，也正好都（注意是都，也就是两个）被真实结构所对齐重叠了。

所以说（x，y）处PAE值越低，也就是置信度越高，说明我的模型在估计第1和第727这两个残基的相对位置是比较准确的，是和真实结构相差不大的。

那么我们可以外推，对于一个置信度比较高的矩形区域，也就是下面这种深绿色的区域，这意味着什么？

首先，一个深绿色的点（x，y），表明model预测x、y之间相对位置比较准确；

那个一堆点呢，表明什么？

比如说（x1：xn）x （y1：yn），就表明x1-xn这个区域和y1到yn这个区域，这两个区域之间任意一对点，也就是任意一个残基组合，预测都是比较准的，

也就是说对于x1-xn、y1-yn这两个区域之间残基群体，这个群体的内部空间组织，我是有把握的，它们怎么组织、空间距离如何，我都是有把握、预测的都比较准确的。

我们再反推一下，什么样的区域内（就什么样的一个残基群体），我们是有把握预测一种内组织/自组织/空间群体结构稳健的规律的？

其实就是结构域，因为一个结构域比较保守，所以一个结构域内每个残基怎么放置、怎么旋转，相对位置如何如何其实都是比较固定的，所以对于结构域，是能够一大片残基群体（两两组合）之间都能够预测把握的比较准的。

所以，对于一个一个的高置信度区域，也就是一个一个的深绿色区域，我们可以简单理解为是一个相对自组织完好/空间组织相对固定/可能比较保守的一个空间组织单元，或者简单理解为一个结构域。

当然，我上面的这些看法只是通俗地解释一下，仅供参考。

（另外注意一下PAE这个图不是对称的！！！看看定义就能够想明白了）

此处再次强调，PAE这个指标非常重要！pLDDT是看局部置信度的，我们只看在局部用这个指标，那么全局我们必须得用上PAE的信息！

官网给了一个非常简洁却有意思的例子：

下面是一个蛋白质的预测结构，我深绿色标注出来的就是两个结构域，因为结构域内部组织比较保守，所以PAE会比较高（这一点我前面通俗解释过了）。

一般常人看到这个结构，脑回路一般是这样的：

哇，pLDDT好高的两个结构域，肯定可信（PAE分数也没问题，局部一团绿）！

哇，居然距离还离得这么近，一定说明这两个结构域是互作的！

两个哇叠加在一起，简直是喜上加喜，我立马有了一个idea，就叫做xx蛋白中两个结构域的互作！

然而，结果是错，而且是大错特错！

为什么，到底很简单，看看这两个结构域所代表的区域之间的PAE分数，

想象一下，把第一个结构域抽象成region1，第二个是region2，我们来看一下region1 x region2这一块区域，

就是下图我圈出来的这个橙色圆圈，我们可以看到（region1，region2）这个区域的PAE分数非常低，说明对于region1和region2之间的相对距离，我们的预测结果是相当没有把握，哦豁，我们的假设泡汤了！

（总而言之，将区域抽象成点，就是对称轴上要看，区域交叉我们也要关注）

下面是几个官网的示例解读：

总而言之，需要整合pLDDT和PAE两个指标来看。

pLDDT是看局部结构可不可靠，也就是order/disorder，局部一个东西是不是真的？

PAE是看局部结构之间的相关关系、相关定位准不准，两个真的东西之间的摆放相对关系是不是真的？

AlphaFold-Multimer 中的置信度分数

主要是复合物预测这方面提出了两个新的置信度指标，

pTM是指复合物整体结构预测的准确性，然后以0.5为一般的判断标准；

ipTM也是一个结构相对位置的指标，而且官方明确说明ipTM这个指标可能比pTM更有用。

比如说我手头上有这么一个预测结构：

一般给出来的4个指标都全了，我个人是习惯先看pTM，先看看整体可不可靠（iPTM我一般不怎么看，暂时也没想到怎么看），如果pTM还行，我需要深入每一个结构，那我再看pLDDT也就是结构中哪些区域可靠，如果可靠的话，我再看这些pLDDT可靠的结构域之间的PAE是否可靠？ 至于复合物之间，也就是大单元之间的iPTM，只有一个数值，暂时没想到放在什么顺序看比较好。