单基因gsea_GSEA：基因集富集分析和ssGSEA:单样本基因集富集分析

传统富集分析(基于超几何分布或者Fisher精确检验)：关注一列差异基因是否是随机分布在某一感兴趣的基因集中(某通路的基因)

得到通路富集的结果时：

(1)、一条通路中既有上调基因又有下调基因，无法确定这条通路总体的表现形式(是抑制还是激活)

将上调和下调的差异基因分开进行分析。

(1)这样分析会对结果产生偏倚，因为Fisher精确检验就是想要证明整个差异基因列表不是抽样得到的，如果将上下调基因分开，就对结果的随机性造成了干扰，最后得出结论的准确性也大大降低。

(2)当上调和下调基因分开富集，富集到同一条通路时，无法解释。

传统富集分析只能定位到差异基因的功能，无法解释这个功能具体的表现形式。

GSEA分析原理：

1、选择MsigDB中一个或者多个功能基因集进行分析

2、表达谱中的基因根据其表达量的差异度进行排序。

GSEA中提供5种差异度的计算方法signal2noise(默认)、t-Test、ratio_of_class(FC)、diff_of_class、log2_ratio_of_class(log2(FC)

第一步：基因排序

利用基因的表达数据，计算每个基因在两组样本(classA，classB)中的差异度，根据差异度从大到小排序，形成一个排好序的基因列表(GeneList)。

第二步：计算富集得分ES

某通路中的基因(Gene set S)

Gene list中基因总数为N

在gene set S中找在genelist中存在的基因计数为N_H,并将这些基因的差异度相加定义为Σ

对Gene list中的任意一个基因

(1)   如果基因属于gene set S，该基因的得分为：FC/Σ

(2)   如果基因不属于gene set S，该基因的得分为：-1/(N -N_H)

第三步：评估富集得分(ES)的显著性

排序gene list 中FC值不变，将基因的顺序打乱，根据上述方法计算ES’，重复1000次，得到1000个ES’，观察真实的富集得分ES出现的可能性。

GSEA结果解读：

第一部分是Enrichmentscore折线图：显示了当分析沿着排名列表(基因列表L)计算基因集S中每一个基因的ES值时，累计ES值的变化趋势。最高峰处的得分便是该基因集S的ES值。

第二部分，用线条标记了基因集S中每个基因出现在基因排序列表中的位置，黑线基因集S(功能注释通路)中的基因位于排序基因列表L中。leading edge subset 就是到绿色曲线峰值ES出现对应的这部分基因(通常情况下，ES大于0，为ES左侧的基因集合；ES小于0，为ES右侧的基因集合)。

第三部分是排序后所有基因rank值得分布，热图红色部分对应的基因在case组中高表达，蓝色部分对应的基因在control组中高表达，每个基因对应的信噪比(Signal2noise，前面选择的排序值计算方式)以灰色面积图显展示。在上图中，我们一般关注ES值，峰出现在排序基因集的前端还是后端(ES值大于0在前端，小于0在后端)以及Leadingedge subset(即对富集贡献最大的部分，领头亚集或和核心基因集)；在ES图中出现领头亚集的形状，表明这个功能基因集在某处理条件下具有更显著的生物学意义；

Single sample gene set enrichment analysis(ssGSEA)

ssGSEA(single sample GSEA)主要针对单样本无法做GSEA而提出的一种实现方法，原理上与GSEA是类似的。

ssGSEA根据表达谱文件计算每个基因基因表达值的rank值，再进行后续的统计分析。通过这个方法，我们可以得到每个样本的免疫细胞或者免疫功能，免疫通路的活性，然后根据免疫活性进行分组。

ssGSEA根据表达谱文件计算每个基因的rank值，再进行后续的统计分析。通过这个方法，我们可以得到每个样本的免疫细胞或者免疫功能，免疫通路的活性，然后根据免疫活性进行分组。