荧光和量子点的基本原理和发展历史 / 数码显微镜摄像头和图像分析的基础技术术语定义

无处不在的荧光显微镜技术改变了显微镜学家对研究对象进行成像、标记和追踪的方式，不论是整个生物体，还是单个蛋白质等等。

本文将探讨什么是 “荧光”，包括其定义背后的历史和基础物理原理，绿色荧光蛋白（GFP）的发现和应用，并展望量子点等荧光探针不断扩大的应用领域。

November 15, 2017
Authors
Martin Wilson , PhD

我们如何定义 “荧光”？

在任何搜索引擎中输入 “荧光的定义”，你会得到以下语句，或者非常相似的内容；

“由较短波长的入射辐射，如 X 射线或紫外线，某些物质会发出可见或不可见的辐射。”

这个定义与荧光显微镜（图 1）有何关联呢？“波长较短的入射辐射” 只是用来 “激发” 样品发射荧光的光源。这种光线包括可见光、紫外线（UV）和红外线（IR），显微镜的光源可以是汞或氙弧光灯，也可以是激光。荧光基团（即上述定义中的 “某些物质”）是具有特殊性质的化合物，它们在较短波长光线的激发下，可以再次发射较高波长的光线 / 光子。

图 1：荧光显微镜下显示的荧光标记细胞。

波长的基本单位是米，“波长” 定义为光波的两个连续波峰或波谷之间的距离。波长的符号是希腊字母 λ(l)。显微镜使用的波长通常以纳米（nm）为单位，可见光谱段在 400 至 700 纳米之间，紫外光谱段在 400 纳米以下，红外光谱段从 700 纳米开始（图 2）。

图 2：可见光光谱

荧光基团按其激发和发射波长分类，通常以图形的形式显示最大波峰。荧光基团在所谓的 “基态” 中自然稳定。它们吸收到（来自 “较短波长” 入射光的）光子时，光子的能量将荧光基团的电子提升到更高能量的 “激发” 状态。被激发的电子不会保持在这种状态，而会失去振动能量，并在返回基态时发射出一个较长波长的光子。对于显微镜使用荧光基团，从激发到返回基态的一个完整周期需要 0.5 到 20 纳秒。

荧光基团的激发和发射波长通常缩写为希腊字母 lambda，加上下标 “ex”（激发）或 “em”（发射；即 lex 或 lem）。

每个荧光基团都有一个不同的最大激发和发射谱段，这一特性用来区分同一样品中的不同标靶。例如，使用荧光染色剂 DAPI (4’,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）高亮显示细胞中的核蛋白，同时使用荧光标记的鬼笔环肽来高亮显示肌动蛋白细胞骨架。

荧光的雅布隆斯基图

波兰物理学家亚历山大・雅布隆斯基（Aleksander Jablonski，1898-1980）首先用三能级能量图描述了基态 / 激发 / 发射之间的循环，因此称为 “雅布隆斯基图”。 1930 年，他凭借题为《关于激发光波长变化对荧光光谱的影响》的论文获得华沙大学博士学位。1933 年，他在《自然》杂志上发表了自己的论文（《染料中反斯托克斯荧光的效率》”），其中含有雅布隆斯基图。这种简单而有效的示意图清晰表现出荧光基团从基态到激发态的激发行为，然后在发射较长波长光子后回到基态（图 3）。

虽然图 3 是简化版的雅布隆斯基图，但应该可以注意到，荧光基团可以存在多个不同的激发和发射状态。此外，荧光基团可以通过不同的弛豫状态返回基态，这些弛豫状态被称为 “三重态”，具体取决于分子的电子自旋。

斯托克斯位移

乔治・加布里埃尔・斯托克斯爵士（1819-1903）是爱尔兰数学家和物理学家，他一生中在光学和光线领域颇有建树。1849 年他受命担任剑桥彭布罗克学院的卢卡斯数学教授，并一直担任该职务，直到 1903 年去世。他写了一篇文笔优美的描述性论文，发表于 1852 年，名为《论光的折射性的变化》[1]。他在论文中使用的语言不同于我们在现代科学文献中使用的语言。以下是斯托克斯爵士所用精彩语言的两段简短摘录；

“去年深秋，虽然因为节气迟来，观察机会不多，我从不同渠道得知，之前提到过的那种具有高内色散性的黄色玻璃采用氧化铀染色。”

以及：

“看到试管在浸入不可见光线的瞬间点亮，这当然是一个奇怪的景象：那实际上是可见的黑暗。总的来说，这种现象有点不可思议。”

“斯托克斯位移” 这词就是为了纪念这位科学家。当激发的电子回到基态并发出光子时，其波长始终大于激发荧光基团的入射光线的波长。这是由于光的特性，即波长与辐射能量成反比。斯托克斯位移描述了荧光基团的峰值激发波长和峰值发射波长之间的差值（以纳米为单位）（图 4）。