JEV NS1‘蛋白通过诱导隧道纳米管形成增强细胞间病毒传播

脑炎病毒作为黄病毒科的经典成员，长期在东亚与东南亚地区维持高流行态势。该病毒以蚊媒传播为特征，可在猪、鸟类及人类中引起不同程度的神经侵袭性疾病。尽管JEV的基因组结构已被解析数十年，其非结构蛋白NS1'的功能直至近年才逐渐浮出水面。NS1'由NS2A编码区发生-1位程序性核糖体移码产生，较NS1多出52个氨基酸。

既往研究提示NS1'可协助病毒逃逸宿主Ⅰ型干扰素，但对其在细胞间直接传播中的角色则知之甚少。隧道纳米管（TNTs）是直径0.1–1 μm、跨细胞间距可达数百微米的F-actin富集膜管，已被多种病毒利用以规避胞外免疫因子，而JEV是否通过类似机制实现高效播散尚未阐明。

作者首先利用实验室保存的JEV野生株HEN0701及其NS1'缺失突变株rT24A开展体外实验。A549、BMDM及BMDC三种细胞模型在感染24 h后，经phalloidin标记F-actin，并借助共聚焦显微观察发现，HEN0701诱导的TNTs数量显著高于Mock对照及rT24A突变株，提示NS1'是触发TNT形成的关键因子。

统计表明，JEV主要诱导“厚型”TNTs，管径>0.7 μm，可同时容纳F-actin与微管，利于大分子或完整病毒颗粒的跨细胞转运。免疫荧光显示，病毒结构蛋白prM/E与非结构蛋白NS1/NS1'/NS3均沿TNTs呈线性分布，进一步支持病毒组分通过该结构进行胞间传递。

为明确NS1'是否足以独立诱导TNTs，研究者在A549细胞中瞬时表达NS1-FLAG与NS1'-FLAG。结果显示，仅NS1'即可使TNTs数量升至NS1组的2.8倍，且NS1'蛋白颗粒沿新生TNTs显著富集。将重组表达的分泌型NS1'以20 μg/mL浓度外源加入BMDC培养体系，未见TNTs增多，表明膜定位而非胞外暴露是NS1'发挥作用的先决条件。

机制层面，作者聚焦Rho家族下游效应分子PAK1与PAK2。共聚焦与共免疫沉淀实验证实，NS1'与PAK1存在直接相互作用，而NS1则未能检测到结合信号。使用AbMole提供的PAK1抑制剂IPA-3（20 μM）预处理30 min，可显著削弱NS1'诱导的TNTs形成，且对细胞活力无显著影响。进一步，通过siRNA敲减PAK1后，JEV吸附阶段未受干扰，但入侵与复制阶段病毒RNA水平下降70%以上，表明PAK1在病毒生命周期中扮演多重角色。

IPA-3 | 42521-82-4 | AbMole

鉴于TNTs依赖肌球蛋白介导的货物运输，作者检测了MYO5a、MYH9、MYO10的转录水平，发现仅有MYH9在JEV感染后显著上调。MYH9编码的非肌球蛋白ⅡA（NM-IIA）是调控TNT张力与运输效率的核心马达蛋白。使用AbMole的ML-7（5 μM）抑制肌球蛋白轻链激酶，或LAT-A（10 nM）阻断F-actin聚合，均可显著减少TNTs数量，并导致上清病毒滴度下降约1 log，提示NM-IIA介导的机械力传递对病毒胞间扩散至关重要。共聚焦显示NM-IIA与NS1'在胞内及TNTs中共定位，免疫共沉淀亦证实两者存在物理相互作用。ML-7 hydrochloride | 110448-33-4 | AbMole | ML-7 HCl

功能性验证环节，作者利用EDIII多克隆抗体构建中和体系。该抗体在1:64稀释度即可抑制BHK-21单层90%以上斑块形成。然而，当BMDC预先感染JEV并在200 μg/mL中和抗体存在下继续培养36 h，胞内病毒RNA水平仍持续上升，提示病毒通过TNTs完成胞间传播，从而逃逸抗体介导的胞外阻断。

尤为关键的是，rT24A突变株在中和抗体条件下的感染效率显著低于HEN0701，进一步确认NS1'介导的TNTs是病毒突破体液免疫屏障的重要路径。若在体系中加入IPA-3阻断TNTs形成，则即便存在中和抗体，病毒滴度仍被抑制至检测限以下，证明TNTs是JEV在免疫压力下实现播散的核心通道。

本研究系统阐明了JEV NS1'蛋白通过PAK1-NM-IIA轴驱动TNTs形成，进而实现病毒高效胞间传播的分子机制。实验全程采用AbMole的IPA-3、ML-7、LAT-A等高品质试剂，确保信号通路抑制与细胞骨架干扰的可重复性与特异性。该发现不仅拓展了对黄病毒传播策略的认知，也为未来干预JEV播散提供了新的分子靶点。