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16S rRNA 高通量测序方法

1. 样本采集与 DNA 提取
   本研究的样本来源于 （描述样本来源，如肠道、土壤、唾液等），采集后迅速置于 -80°C 超低温冰箱保存，避免微生物组成变化。DNA 提取采用 MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA） 或 Qiagen DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen, Germany），按照试剂盒说明书操作。DNA 提取的质量通过 NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific, USA） 测定 A260/A280 比值（1.8~2.0 为合格），同时使用 Qubit 3.0（Invitrogen, USA） 进行荧光定量测定，并在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测 DNA 完整性。

2. 16S rRNA 基因扩增
   使用细菌通用引物扩增 16S rRNA 基因的 V3-V4 高变区，引物序列如下：
   正向引物（Forward primer, 341F）：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’
   反向引物（Reverse primer, 806R）：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’

PCR 扩增条件：

95°C 预变性 3 min
95°C 变性 30 s
55°C 退火 30 s
72°C 延伸 45 s
30 个循环（steps 2-4）
72°C 终延伸 5 min
PCR 产物在 **2% 琼脂糖凝胶电泳（120V，40 min）**上检测，并使用 QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen, Germany） 纯化。

3. 测序文库构建与高通量测序
   纯化后的 PCR 产物使用 NEBNext® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina®（New England Biolabs, USA） 进行测序文库构建。建库过程中，先采用 A-T 连接适配子（adapter ligation），然后利用 AMPure XP 磁珠（Beckman Coulter, USA） 进行片段筛选。文库质量评估使用 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent Technologies, USA） 和 Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen, USA） 进行浓度测定。

文库构建完成后，在 Illumina NovaSeq 6000 或 MiSeq PE250/PE300 平台（Illumina, USA） 进行 250 bp 或 300 bp 双端测序（paired-end sequencing），由商业测序公司（如 Novogene、BGI、Personalbio）完成。

4. 原始数据处理
   测序生成的原始数据（raw reads）以 FASTQ 格式存储，利用 QIIME2（v2022.8） 进行质量控制和后续分析。

去除低质量数据：

使用 Cutadapt（v1.9.1） 去除接头（adapter）污染序列；
采用 DADA2（Divisive Amplicon Denoising Algorithm, v1.18） 进行噪声过滤，去除低质量碱基、嵌合体（chimera），并去除单一出现的序列（singleton）。
拼接（Merge Paired-end Reads）：

利用 VSEARCH（v2.15.2） 拼接双端序列，参数设定为 --fastq_mergepairs --fastq_minovlen 20 --fastq_maxdiffs 5。
非冗余特征表（ASV, Amplicon Sequence Variant）构建：

采用 DADA2 生成 ASV（替代传统的 OTU 操作分类单元），提高物种分类分辨率。
物种注释（Taxonomic Assignment）：

物种注释采用 SILVA 138 或 Greengenes 数据库，使用 Naïve Bayes 分类器 进行比对。
5. 统计分析与可视化
Alpha 多样性（Alpha diversity）：

计算 Shannon 指数、Chao1 指数、Simpson 指数（用于测定样本内微生物群落的丰富度和均匀度）。
使用 Wilcoxon 秩和检验（Wilcoxon rank-sum test） 评估组间差异。
Beta 多样性（Beta diversity）：

计算 Bray-Curtis 距离、Unweighted UniFrac 和 Weighted UniFrac 距离矩阵，评估样本间微生物组成差异。
使用 主坐标分析（PCoA） 和 非度量多维缩放分析（NMDS） 进行可视化。
组间差异分析：

使用 LEfSe（Linear discriminant analysis Effect Size） 识别显著差异菌群（LDA Score > 2）。
采用 DESeq2（R 语言包） 进行差异丰度分析，筛选出显著差异菌（p < 0.05, FDR 校正）。
功能预测：

利用 PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States, v2.4.2） 预测微生物群落的潜在功能，分析 KEGG 和 MetaCyc 代谢通路。
6. 结果展示
所有统计分析和可视化图表均在 R 语言（v4.1.2） 和 Python 3.8 环境下完成，使用 ggplot2、phyloseq、vegan、pheatmap 等 R 包进行可视化，包括：

Alpha 和 Beta 多样性分析（箱线图、PCoA/NMDS 散点图）。
物种相对丰度柱状图（Phylum、Genus 级别）。
差异分析火山图（Volcano plot）。
LEfSe 线性判别分析柱状图。

结果解释

(1) NC 组富集的菌群
Faecalibacterium（粪杆菌属）
该属属于厚壁菌门（Firmicutes），是短链脂肪酸（SCFA） 生产者，特别是 丁酸（Butyrate）。
益生菌作用：具有抗炎功能，可维持肠道屏障稳定性，减少胃肠道炎症。
CAG 组减少 可能表明 抗炎菌群下降，胃肠道炎症增加。
Bacteroides（拟杆菌属）
该属属于拟杆菌门（Bacteroidota），是健康肠道中的主要共生菌群之一。
具有 参与脂肪酸和胆汁酸代谢的功能，可以分解复杂的碳水化合物并促进脂肪酸合成。
CAG 组减少 可能意味着脂肪酸生物合成减少，影响宿主能量代谢。
Bifidobacterium（双歧杆菌属）的基本特征
属于 放线菌门（Actinobacteria），是一类革兰氏阳性、厌氧或兼性厌氧的益生菌。
主要定植在肠道（尤其是婴儿期）和胃肠道上部，并在维持肠道稳态、调节免疫 方面发挥重要作用。
其主要代谢特点：
糖代谢强：通过发酵糖类（如乳糖、低聚糖）产生乳酸和乙酸，但不产生丁酸（与 Faecalibacterium 不同）。
竞争性抑制病原菌，提高胃肠道屏障功能。
与宿主免疫系统交互，可能在炎症环境中调整自身代谢方式。
(1) 胃酸减少，使双歧杆菌更易定植
正常情况下，胃酸（pH≈2）会抑制大多数外源菌在胃部的定植，但在 CAG 组，由于胃酸分泌减少，胃 pH 升高（≈4~5），这可能为 Bifidobacterium 提供更有利的生存环境。
其他乳酸菌（如 Streptococcus）也在 CAG 组增加，表明胃肠道的菌群向 糖代谢优势菌群 偏移。
(2) 肠道炎症状态改变菌群生态位
慢性萎缩性胃炎（CAG）通常伴随胃肠道低度炎症，宿主的 免疫系统改变 可能影响肠道菌群结构：
Bifidobacterium 具有一定的抗炎作用，可能通过竞争性排斥炎症相关菌（如 Proteobacteria）在 CAG 组中扩增。
在炎症环境中，Bifidobacterium 可能适应性扩增，以维持一定程度的菌群平衡。
(3) CAG 组碳水化合物代谢增强，适合 Bifidobacterium 生长
Bifidobacterium 主要代谢寡糖和糖类，而非脂肪酸，其在 CAG 组中的增加可能反映 碳水化合物代谢菌群的富集：
Faecalibacterium（SCFA 生成菌）减少，导致脂肪酸生物合成下降，而糖酵解代谢增强。
Streptococcus 也富集，进一步支持糖代谢增强的假设。
(4) CAG 可能影响胆汁酸代谢，促进双歧杆菌扩增
胆汁酸可调节肠道菌群结构：
Bifidobacterium 通常耐受低胆汁酸浓度，在胆汁酸代谢异常的情况下可能相对扩增。
CAG 可能导致胆汁酸代谢紊乱，进而影响特定菌群的竞争生态位，使 Bifidobacterium 得以扩增。
Bifidobacterium 在 CAG 组增加的可能影响
(1) 可能对宿主产生部分保护作用
双歧杆菌的抗炎作用 可能在 CAG 组中起到一定的保护作用：
竞争性抑制炎症相关菌（如 Escherichia-Shigella, Klebsiella），防止肠道菌群进一步恶化。
可能增强宿主免疫调节能力，缓解 CAG 相关的胃肠道炎症。
(2) 可能与短链脂肪酸（SCFA）失衡相关
Bifidobacterium 主要生成乳酸和乙酸，而非丁酸：
在 NC 组，Faecalibacterium（丁酸生成菌）更丰富，有助于脂肪酸生物合成。
在 CAG 组，Bifidobacterium 富集，可能导致 SCFA 组成改变，影响脂肪酸代谢。
(3) 可能与糖代谢增强相关
Bifidobacterium 在 CAG 组扩增可能表明菌群代谢向糖代谢倾斜，而非脂肪酸代谢：
链球菌（Streptococcus）和变形菌门（Proteobacteria）在 CAG 组富集，说明 CAG 组更倾向于糖酵解代谢。
Bifidobacterium 可能在这一代谢背景下扩增，以适应糖代谢环境。
CAG 组富集的菌群
Streptococcus（链球菌属）
CAG 组显著升高，可能是由于 胃酸分泌减少（胃 pH 升高），使口腔细菌更容易定植于胃部和小肠。
代谢特点：链球菌主要依靠糖酵解产生乳酸，而不参与脂肪酸生物合成。
影响：
促进炎症反应，可能加重胃黏膜损伤。
可能减少短链脂肪酸（SCFA）的产生，进一步影响宿主代谢稳态。
Escherichia-Shigella（大肠杆菌-志贺氏菌属）
该属属于 变形菌门（Proteobacteria），通常与炎症性疾病（如 IBD、胃炎）相关。
CAG 组中明显升高，可能意味着 肠道屏障功能受损，促炎菌群扩增。
Klebsiella（克雷伯氏菌属）
也是 变形菌门（Proteobacteria） 的成员，与 抗生素耐药性、宿主免疫失衡 相关。
CAG 组升高 可能表明 炎症环境有利于条件致病菌扩增。
Megamonas（巨单胞菌属）
属于厚壁菌门（Firmicutes），通常与糖代谢增强相关。
CAG 组增加 可能意味着菌群代谢偏向糖酵解，而非脂肪酸合成。

这张 LEfSe（Linear Discriminant Analysis Effect Size）柱状图 展示了 CAG（慢性萎缩性胃炎组） 和 NC（正常对照组） 在微生物分类单元（从目级 o__ 到属级 g__）的显著差异菌群，并通过 LDA（线性判别分析） 评估不同菌群在两组之间的富集情况。
X 轴（LDA 分数）：数值越大，表明该菌群在相应的组中富集程度越高。
颜色区分：
粉色（CAG 组）：这些菌群在 CAG 组 显著富集，可能与 CAG 的发病机制有关。
蓝色（NC 组）：这些菌群在 NC 组 显著富集，可能与健康胃肠道的稳态维持有关。

1. CAG 组（粉色）富集菌群的意义
   在 CAG 组中富集的菌群主要是 变形菌门（Proteobacteria）和乳酸菌类（Lactobacillales, Streptococcus）：
   (1) o__Enterobacterales（肠杆菌目）、p__Proteobacteria（变形菌门）
   CAG 组显著增加，表明促炎菌群扩增，可能导致或加重胃肠道炎症。
   变形菌门（Proteobacteria）富集通常与胃肠道疾病、炎症和代谢紊乱相关。
   Enterobacterales 属于 革兰氏阴性菌，可产生 脂多糖（LPS，内毒素），激活炎症通路（如 NF-κB），可能加剧胃黏膜损伤。
   (2) c__Gammaproteobacteria（γ-变形菌纲）、f__Enterobacteriaceae（肠杆菌科）
   这类细菌是肠道病原菌的常见成员，可能与肠道屏障受损和炎症有关。
   CAG 组的胃黏膜可能更容易受到这些菌群的侵袭，进一步加重胃部损伤。
   (3) o__Lactobacillales（乳酸菌目）、g__Streptococcus（链球菌属）、f__Streptococcaceae（链球菌科）
   CAG 组乳酸菌（如 Streptococcus）显著增加，可能由于 胃酸减少，导致本来主要在口腔定植的链球菌扩增至胃部和肠道。
   链球菌属（Streptococcus）偏向糖酵解代谢，生成乳酸，可能影响肠道 pH 值，进一步促进病原菌的生长。
   可能与幽门螺杆菌（H. pylori）形成共生关系，促进 CAG 的发展。
   (4) c__Bacilli（芽孢杆菌纲）
   一些 Bacilli 可能耐受酸性环境，并在胃部疾病中发挥作用。
   在胃酸减少的 CAG 组中，这类菌可能作为继发性菌群扩增。
2. NC 组（蓝色）富集菌群的意义
   在 NC 组中富集的菌群主要是 厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），这些菌群通常与健康胃肠道功能、抗炎和短链脂肪酸（SCFA）代谢相关。
   (1) o__Oscillospirales（振荡单胞菌目）、c__Clostridia（梭菌纲）
   这些菌群通常富含 丁酸生成菌（如 Faecalibacterium），有助于维持肠道稳态和能量代谢。
   Oscillospirales 具有抗炎特性，并促进脂肪酸代谢，其在 NC 组富集可能表明其在健康状态下的重要作用。
   (2) f__Ruminococcaceae（瘤胃球菌科）
   该科细菌通常在健康个体中较丰富，参与膳食纤维降解，并促进短链脂肪酸（SCFA）合成。
   CAG 组减少可能表明 SCFA 生成降低，影响胃肠道代谢平衡。
   (3) p__Bacteroidota（拟杆菌门）、o__Bacteroidales（拟杆菌目）、c__Bacteroidia（拟杆菌纲）
   拟杆菌门（Bacteroidota） 是健康肠道菌群的重要组成部分，能够：
   参与 胆汁酸代谢，调节宿主能量代谢。
   促进 脂肪酸生物合成，有助于维持胃肠道健康。
   在 CAG 组减少，可能意味着 脂肪酸代谢紊乱、胆汁酸代谢异常和 SCFA 生成减少。
   (4) g__Faecalibacterium（粪杆菌属）、s__Faecalibacterium_unclassified
   Faecalibacterium 是重要的抗炎菌，可产生丁酸（Butyrate），维持肠道屏障功能。
   在 CAG 组显著减少，可能加剧胃肠道炎症，并影响脂肪酸代谢。
   (5) g__Prevotella_9、f__Prevotellaceae（普雷沃菌科）
   Prevotella 属细菌通常与健康饮食和 SCFA 代谢相关。
   在 NC 组富集，可能有助于维持胃肠道稳态

该图表显示了 CAG（慢性萎缩性胃炎组） 与 NC（正常对照组） 在微生物功能预测通路上的差异。主要的解析维度包括：

左侧柱状图（Mean proportions）：

代表每个功能通路在 CAG（橙色）和 NC（蓝色） 组中的相对丰度。
误差棒代表置信区间（95% CI）。
右侧散点图（Difference in mean proportions）：

代表两组之间功能通路的差异（CAG - NC）。
正值（右侧）：CAG 组显著高于 NC 组。
负值（左侧）：CAG 组显著低于 NC 组。

1. 主要发现

(1) CAG 组显著升高的功能通路（右侧散点图，橙色点）
与病原菌和炎症相关的通路增加：
Histidine metabolism（组氨酸代谢）
beta-Lactam resistance（β-内酰胺耐药性）
Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450（细胞色素 P450 代谢外源物质）
Drug metabolism - cytochrome P450（细胞色素 P450 药物代谢）
Staphylococcus aureus infection（金黄色葡萄球菌感染）
Primary immunodeficiency（原发性免疫缺陷）
Epithelial cell signaling in H. pylori infection（幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号通路）

✅ 解读：CAG 组病原菌信号通路增强
H. pylori 感染相关通路显著增加，可能表明 CAG 组的微生物群落中 幽门螺杆菌或其他病原菌的活性增强，导致胃部免疫信号异常。
β-内酰胺耐药性增加，提示 CAG 组可能存在更多耐药菌群，这在慢性炎症环境下可能与长期抗生素暴露相关。
P450 相关通路升高，提示 细菌可能通过药物代谢或毒性分子代谢增强 适应炎症环境。

(2) CAG 组显著降低的功能通路（左侧散点图，蓝色点）
与能量代谢、免疫调控和脂肪酸代谢相关的通路减少：
Oxidative phosphorylation（氧化磷酸化）
Translation factors（翻译因子）
Tyrosine metabolism（酪氨酸代谢）
Retinol metabolism（视黄醇代谢）
Fatty acid biosynthesis（脂肪酸生物合成）
Butirosin and neomycin biosynthesis（布替霉素和新霉素生物合成）
Lipid biosynthesis proteins（脂质生物合成蛋白）
NOD-like receptor signaling pathway（NOD 样受体信号通路，参与炎症应答）
Antigen processing and presentation（抗原加工和呈递）

✅ 解读：CAG 组能量代谢下降
脂肪酸生物合成减少，支持之前的分析，即 CAG 组的微生物代谢向糖代谢偏移，而非脂肪酸代谢，可能导致胃肠道能量供应不足。
氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）下降，表明 CAG 组微生物的能量代谢能力降低，可能影响宿主代谢稳态。
抗原加工和呈递下降，提示 宿主免疫识别能力可能受损，可能影响抗感染能力。
2. 结合微生物学解释
CAG 组的微生物群落更倾向于致病菌（Proteobacteria, Enterobacterales, Streptococcus）
这些菌群通常具有较强的耐药性和病原相关基因，这可能解释 β-内酰胺耐药性增强。
H. pylori 相关信号通路增加，可能提示幽门螺杆菌在 CAG 组的高丰度。
NC 组的微生物群落富含短链脂肪酸（SCFA）生成菌（Bacteroidota, Faecalibacterium, Oscillospirales）
这些菌群主要参与 脂肪酸生物合成和能量代谢，其减少可能导致 CAG 组脂肪酸生物合成下降。