创伤后脑积水患者脑脊液纤维化指标升高

分流依赖性创伤后慢性脑积水患者脑脊液中纤维化指标升高

摘要

目的：既往研究提示，脑脊液（CSF）循环通路中的纤维化改变可能与脑积水的发生发展存在关联。这些纤维化指标的变化可能反映脑积水的严重程度，并有潜力成为诊断工具。本研究旨在分析创伤后脑积水患者脑脊液中I型前胶原C端前肽（PICP）、III型前胶原N端前肽（PIIINP）、透明质酸（HA）和层粘连蛋白（LN）的水平，并评估其存在的意义。研究对象与方法：共纳入44例患者，其中24例为分流依赖性创伤后脑积水患者（A组——脑积水组）；10例为无脑积水表现的脑外伤患者（B组——创伤组）；10例为无脑外伤及脑积水的患者（C组——正常对照组）。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测各组脑脊液中 PICP、PIIINP、HA、LN及转化生长因子‐β1（TGF‐β1）的水平。结果：脑积水组患者脑脊液中PICP、PIIINP、HA和LN的水平显著高于无脑积水的创伤患者（p < 0.05）和正常对照组患者（p < 0.05）。此外，PICP、PIIINP、HA和LN水平的升高与TGF‐β1水平呈正相关（p < 0.05）。结论：我们证实了纤维化相关因子（包括PICP、PIIINP、HA和LN）的升高，并且其水平与TGF‐β1呈正相关。这表明纤维化过程在创伤后慢性脑积水的发生发展中具有重要作用，并提示PICP、PIIINP、HA和LN在分流依赖性创伤后慢性脑积水的诊断中具有潜在应用价值。

关键词

•纤维化 •透明质酸 •脑积水 •层粘连蛋白 •前胶原蛋白 • TGF‐β 1

介绍

慢性脑积水是颅脑创伤后常见的并发症。其特征是脑脊液（CSF）循环和吸收异常，导致脑室扩张。大多数脑脊液吸收障碍的患者将依赖分流术。既往研究认为，脑脊液流动通路中的纤维化所引起的脑脊液吸收障碍，在脑积水发病机制中起重要作用[8, 9, 10,18,20,34‐36]。

PICP、PIIINP、HA和LN被广泛认为是纤维化疾病的生物标志物，在脑积水动物模型的脑脊液中已检测到这些物质水平升高 [11,12, 39, 42]。然而，脑脊液循环通路的纤维化在创伤后脑积水患者中的作用仍不明确。

本研究的目标是目的是确定依赖分流术的创伤后脑积水患者脑脊液中的纤维化指数，以进一步了解脑积水涉及的病理生理机制，并促进更佳的治疗方法和诊断手段的开发。

方法

患者选择

患者被分为3组：A组（脑积水组）包括24例依赖分流术的创伤后慢性脑积水患者；B组（创伤组）包括10例经临床检查和影像学确定无脑积水征象的脑外伤患者；C组（正常对照组）包括10例无创伤或脑积水的患者。

排除标准包括以下情况：先天性脑积水、颅内感染后脑积水、肿瘤梗阻性脑积水及其他原因引起的脑积水。本研究已获得安徽医科大学以及患者或其亲属的伦理批准和知情同意。所有操作均遵循国家研究委员会的伦理标准以及1964年赫尔辛基宣言及其后续修订或类似的伦理标准。脑积水的诊断由神经外科医生和神经放射科医生作出。

样本采集与检测

脑积水组的脑脊液样本在分流手术期间采集；创伤组样本在颅脑创伤手术期间采集；正常对照组样本在癫痫和三叉神经痛手术期间采集。所有样本均被储存于‐70°C条件下保存用于ELISA检测。为了定量检测血清和脑脊液中的PICP、PIIINP、HA、LN和TGF‐β1，采用商用ELISA试剂盒（武汉博奥森生物技术有限公司，中国武汉）按照制造商说明书进行操作。简而言之，将预先包被有PICP、PIIINP、HA、LN或TGF‐β1抗体的微量滴定板加入标准品和未稀释样本，在37°C孵育2小时。去除标准品和未稀释样本后，加入针对PICP、PIIINP、HA、LN和TGF‐β1特异的生物素标记多克隆抗体，孵育1小时。经过洗涤步骤后，再加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，在37°C孵育1小时。再次洗涤后，加入3’,3’,5,5’‐四甲基联苯胺，在37°C孵育30分钟。用硫酸（H2SO4）终止酶底物反应。立即在450 nm处测量光密度。根据制造商说明，未观察到明显的交叉反应或干扰。

统计分析

数据通常以均值 ±标准差（SD）表示。各组数据采用标准t检验进行比较。在脑积水、创伤和正常对照组之间进行比较。PICP、PIIINP、HA、LN和TGF‐β1水平之间的关系通过Pearson相关性分析确定。均值之间的差异在p< 0.05时被认为具有显著性。

结果

临床状况

3组患者的一般信息见表1。脑积水组患者的一般信息见表2。原发性脑损伤的病因包括蛛网膜下腔出血（SAH）、脑内血肿和轻度脑室出血。所有患者均至少随访了3个月。

存在脑外伤时，患者的格拉斯哥昏迷评分（GCS）为7.9 ± 2.8。脑积水发生在创伤后的第1至第10个月，大多数病例在第二或第三个月发病。一旦出现脑积水症状，病情会迅速进展，并很快需要依赖手术治疗。所有患者的症状在分流手术后均得到改善。

创伤后慢性脑积水脑脊液中的纤维化

通过ELISA检测纤维化指数水平。A组的PICP、PIIINP、透明质酸和层粘连蛋白表达水平升高（*p < 0.05）与B组和C组相比（图1）。采用Pearson相关性分析TGF‐β1与PICP、PIIINP、HA和LN水平之间的关系。PICP、PIIINP、HA和LN浓度的升高与TGF‐β1水平呈正相关（图2）。

PICP、B) PIIINP、C) HA以及D) LN之间的皮尔逊相关性。PICP、PIIINP、HA和LN浓度的升高与TGF‐β1水平呈正相关。)

讨论

根据脑脊液动力学的经典假设，脑脊液在脑室内产生，流向大脑皮层蛛网膜下腔，最终被吸收进入静脉窦。但最近一个被广泛接受的假说认为，脑脊液在整个脑脊液系统中持续产生和吸收，这是由于水分通过毛细血管壁滤过并重新吸收至周围大脑组织的结果 [6, 15, 24, 25]。因此，我们认为纤维化可能影响整个脑脊液通路，导致脑脊液吸收障碍。

纤维化疾病的主要特征之一是细胞外基质过度修复。通常认为，当原发性损伤超过实质细胞的修复能力时，间质结缔组织（细胞外基质）增生将修复缺损。研究表明，脑积水患者中发现的脑脊液循环通路的病理改变涉及细胞外基质数量的增加。

实质细胞数量减少[17, 28]。脑脊液循环通路中细胞外基质的增生可能影响脑脊液吸收 [7, 22, 26]。

细胞外基质主要由胶原蛋白组成，其中85%为I型胶原蛋白，11%为III型，4%为IV型和V型。因此，选择PICP和PIIINP作为胶原纤维形成的指标。透明质酸是一种糖胺聚糖，在细胞外空间中通过非共价结合与蛋白质相连，是蛋白聚糖的主要成分。层粘连蛋白是基底膜的主要糖蛋白之一，可反映糖蛋白水平。在肝纤维化 [19, 24, 29], 特发性肺动脉高压、囊性纤维化 [25], 肾功能衰竭 [38]以及心脏纤维化 [16, 30]中，血清中PICP、PIIINP、HA和LN的浓度被认为可反映纤维化程度。在蛛网膜下腔出血的实验模型中，已发现脑脊液中PICP和PIIINP浓度升高，以及软脑膜I型和III型胶原蛋白的沉积 [23,30, 32, 41]。成纤维胶原（I–III型）由间充质细胞以前胶原蛋白的形式合成。在探寻脑脊液中透明质酸来源的研究中发现，其在脉络丛和软脑膜中的浓度较低，而在大脑皮层表层积聚。对脑脊液中透明质酸进行连续筛查可能在炎症性疾病、肿瘤以及脑脊液流动阻塞 [14]的情况下具有临床价值。根据我们的结果，PICP、PIIINP、HA和LN水平的升高可能提示脑积水是一种纤维化疾病。

在脑积水患者的脑脊液中已发现多种因素：enascin‐C、GFAP、Aβ、VEGF和TGF‐β[1, 19,21, 33]。在因蛛网膜下腔和脑室内出血导致脑室扩张的成人脑脊液中，TGF‐β1浓度升高[39]；而在出血后脑室扩张的婴儿中，TGF‐β1和‐β2均被证实升高[37]。脑室扩张通过向小鼠的脑蛛网膜下腔注射TGF‐β1已实现[27T]。GF‐β1细胞因子超家族由多种同源多肽组成，这些多肽转导参与细胞生长和分化以及炎症反应和组织损伤应答的多种信号。该家族成员TGF‐β1、‐β2和‐β3存在于所有哺乳动物组织中，包括中枢神经系统。它们具有强烈的促结缔组织增生活性，通过增加胶原蛋白及细胞外基质其他多种成分的合成，并参与一系列涉及胶原蛋白和细胞外基质过度沉积的严重疾病，包括糖尿病肾病 [2]和肝硬化 [5,8]。在创伤后慢性脑积水患者中，TGF‐β1被释放到脑脊液中，有证据表明该细胞因子可刺激细胞外基质蛋白的沉积。此过程可能导致脑脊液通路的永久性阻塞[20]。

根据我们的结果，PICP、PIIINP、HA和LN浓度的升高与TGF‐β1水平（一种公认的纤维化因子）呈正相关。这些结果从纤维化的角度进一步加深了我们对脑积水发病机制的理解。

传统上认为脑脊液通过蛛网膜颗粒吸收的理论可能并不完整。有证据表明，脑脊液可通过室管膜和内皮，经由鼻部淋巴管、神经鞘和脊髓蛛网膜下腔等辅助通路到达大脑表面[4, 13, 27, 36, 39]。先前的研究显示，在HT‐X 脑积水大鼠模型中，与对照动物相比，脑脊液向鼻部淋巴管的流出减少[31]。在高岭土性交通性脑积水模型中，淋巴性脑脊液吸收受损，这种障碍的程度可能影响脑积水的严重程度[22]。淋巴循环阻塞还可能诱发进一步的纤维化疾病[42]。因此，有必要继续深入研究淋巴循环与脑脊液之间的关系。

纤维化通路将是一个有吸引力的研究方向。同时，我们注意到调控纤维化可能延缓脑积水的出现。博特菲尔德最近的研究表明，核心蛋白聚糖可以调控因子‐b/Smad2/3，其抗纤维化作用能够延缓脑积水的发展[3]。这一发现也可能为脑脊液流动通路纤维化在脑积水发病机制中的作用提供证据。

本研究存在一些局限性。为了排除PICP、PIIINP、HA和LN浓度升高仅由脑外伤引起的可能性，我们在创伤组中纳入了无脑积水的脑外伤患者。然而，脑积水组与创伤组之间的脑脊液样本采集时间无法统一控制。因此，我们不能断定纤维化指标未升高就表明脑外伤患者未来不会发生脑积水。至少，我们的结果表明，PICP、PIIINP、HA和LN的升高并非由创伤所致，而是与脑积水相关；并且在脑积水发生之前，创伤性脑损伤患者的脑脊液中纤维化因子水平保持正常。

结论

总之，我们证实了在创伤后慢性脑积水中，PICP、PIIINP、HA和LN的水平升高，而在无脑积水的脑外伤患者中则未升高。纤维化指标与脑积水中的TGF‐β1水平呈正相关，具有作为创伤后脑积水生物标志物的潜力。我们的结果还表明，脑脊液流动通路中的纤维化可能在慢性创伤后脑积水的发展中起因果作用，从而提供了一种新的治疗方向。