暴饮乙醇增加小鼠VTA基因表达

原创于 2025-10-20 02:25:14 发布 · 383 阅读

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#乙醇 #Otx2 #VTA #小鼠 #Wnt1

类似暴饮的乙醇饮用增加成年小鼠腹侧被盖区Otx2、Wnt1和Mdk基因表达

卡桑德·科尔斯1,2和艾米·W·拉塞克1
1表观遗传学酒精研究中心，精神病学系，伊利诺伊大学芝加哥分校，芝加哥，伊利诺伊州，美国。2解剖学与细胞生物学系，伊利诺伊大学芝加哥分校，芝加哥，伊利诺伊州，美国。

摘要

酒精使用障碍与多巴胺能系统的病理生理变化相关。同源框基因2（OTX2）是一种转录因子，对位于腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能神经元的发育至关重要，而VTA是大脑中参与药物强化的关键区域。先前的研究表明，胚胎发育期间的乙醇暴露会降低中枢神经系统中Otx2mRNA水平。我们假设，在成年动物中类似暴饮的乙醇摄入会改变OTX2的水平。为了验证这一点，在小鼠采用“黑暗中饮酒”方案连续饮用乙醇4天后，分别通过定量实时PCR和蛋白质印迹法检测小鼠腹侧被盖区中Otx2的mRNA和蛋白质水平。在乙醇饮用后，还检测了VTA中已知或推测的 OTX2转录靶基因（Sema3c、Wnt1和Mdk）的表达。在第四次饮酒阶段24小时后，VTA中的Otx2mRNA和蛋白质水平升高，并且Mdk转录本的表达也相应增加。有趣的是，Wnt1转录本在第四次饮酒阶段结束后立即在VTA中升高，但在24小时后恢复至对照水平。接下来，我们研究了在小鼠VTA中病毒介导的Otx2减少是否会影响乙醇或蔗糖的摄入。将表达靶向Otx2的shRNA或对照shRNA的慢病毒载体注射到VTA中，随后在“黑暗中饮酒”方案中测试小鼠对乙醇和蔗糖的饮用情况。降低VTA中OTX2的水平并未改变乙醇或蔗糖的消耗。一个局限性在于OTX2减少的程度可能不够充分。尽管VTA中的OTX2在成年小鼠类似暴饮的行为中可能不起作用，但它可能参与乙醇诱导的该区域转录变化。

关键词 ：酒精使用障碍，多巴胺，乙醇，小鼠，Otx2，Wnt1，Mdk

引言

根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，酒精滥用是全球第三大可预防的致死因素。与酒精相关的损害对美国造成了巨大的经济负担，其中75%的成本归因于暴饮。1,2迫切需要了解导致暴饮的生物学机制，因为这可能有助于发现新的治疗靶点，从而减少有害饮酒及其相关的健康和经济成本。调节暴饮行为的一个神经解剖学基础是腹侧被盖区（vTA）。vTA中的多巴胺能神经元在药物奖赏和强化中起关键作用，并参与暴饮行为以及酒精使用障碍（AUD）的发展。3乙醇会急性激活vTA内的多巴胺能神经元，4-6 而长期乙醇暴露则会引起多巴胺能系统的适应不良性改变。7-9

同源框基因2（OTX2）是一种转录因子，参与大脑发育过程中腹侧被盖区（vTA）多巴胺神经元的分化，胚胎发育期间的乙醇暴露会改变大脑中Otx2的基因表达。例如，与孕期饮用水的大鼠雄性后代相比，孕期饮用乙醇的大鼠雄性后代全脑中的Otx2mRNA显著减少。小鼠脑干中 Otx2的基因表达也与胚胎形成期间乙醇诱导的细胞死亡数量相关。这些结果提示，乙醇可能通过影响Otx2基因表达来改变多巴胺神经元的发育和/或功能。

青少年小鼠vTA中Otx2蛋白减少与成年后对压力诱发抑郁的易感性相关17 ，且酒精使用障碍与抑郁症之间存在显著共病18-20 。然而，Otx2不仅在胚胎发育期间表达，其在成年小鼠的多巴胺神经元中也持续表达21,22 。据我们所知，成年动物饮酒对vTA中Otx2基因和蛋白水平的影响尚未被研究。因此，在本研究中，我们检测了vTA中 OTX2的mRNA和蛋白质水平

使用成熟的黑暗中饮酒（DID）测试，在达到暴饮水平的酒精摄入后，对成年小鼠腹侧被盖区进行分析。已知腹侧被盖区（vTA）内OTX2转录活性的靶基因包括Wnt1和 Sema3c。因此，除了检测Otx2转录本的表达外，我们还确定了已知及推测的OTX2转录靶点在暴饮水平的乙醇饮用后是否在腹侧被盖区（vTA）发生表达改变。

本文展示的结果表明，小鼠暴饮水平的乙醇摄入会导致腹侧被盖区（vTA）中Otx2mRNA和蛋白质的增加。
我们还发现乙醇诱导了Wnt1以及一个假定的OTX2转录靶基因Mdk的表达上升，并且我们发现Mdk启动子区域含有OTX2结合基序。值得注意的是，我们先前发现，在 VTA中降低Mdk水平会导致小鼠的乙醇摄入增加24。我们假设，在VTA中降低Otx2的表达会产生与降低Mdk相似的效果。因此，为了确定OTX2在乙醇饮用行为中是否具有相关作用，我们使用表达短发夹（sh）RNA的慢病毒载体靶向Otx2进行RNA干扰，以降低小鼠腹侧被盖区中 Otx2的表达水平，并在DID测试中检测乙醇饮用行为。我们的结果为暴饮水平的乙醇摄入对多巴胺能系统中基因表达变化的影响提供了重要的新机制见解。

材料与方法

动物

雄性和雌性C57BL/6J小鼠于8周龄时购自杰克逊实验室（美国缅因州巴港）。实验前，小鼠在12小时反转黑暗周期环境（上午10点关灯）中单只饲养2至3周，并于10至 11周龄开始进行乙醇消耗测试。小鼠可随意获取食物（ Teklad7912饲料，Envigo，美国印第安纳州印第安纳波利斯）。除2小时或4小时的乙醇和蔗糖饮用测试期间外，小鼠也可随意获取水。所有操作均经伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理委员会（许可号16‐144和19‐132）批准。动物护理遵循美国国立卫生研究院Guide f or the Care and Use of Laboratory Animals的规定，并尽一切努力减少动物痛苦。

黑暗中饮酒（DID）

DID测试是一种小鼠暴饮模型，可产生药理学上相关的血液酒精浓度（BALs）(⩾80 mg%)。23在黑暗周期开始3小时后，向每只小鼠的家居笼中提供一根改良的吸管，其中装有20%乙醇（DeconLabs，美国宾夕法尼亚州普鲁士王市）溶于水的溶液或纯水（对照组）。24在进行DID实验前3天的星期五，让小鼠先在一个2小时饮酒阶段内适应装有水的吸管。实验前对小鼠进行称重

DID测试开始前4小时。小鼠在星期一至星期三期间，在黑暗周期开始3小时后，有2小时的时间可以饮用20%乙醇溶液或水，并在每次饮酒阶段结束时测量消耗的液体量。
在第四天（星期四），小鼠有4小时的饮水时间，并在2小时和4小时时分别测量液体消耗量。对于经历反复黑暗中饮酒周期的小鼠（即慢病毒实验），在星期四饮酒阶段结束后将乙醇瓶更换为标准水瓶，并在下一个星期一恢复 DID测试（停用3天，随后连续4天饮用乙醇）。这些相同的小鼠在乙醇饮用测试完成3天后还进行了蔗糖消耗测试，使用与乙醇测试相同的程序提供2%（重量/体积）蔗糖溶液，并在第四次蔗糖饮用测试完成1天后（~20小时）实施安乐死。

VTA解剖

小鼠在第四次饮酒阶段后立即（称为“0小时”组）或24 小时后通过快速断头法实施安乐死，以检测基因表达和蛋白质水平。迅速将大脑从颅骨中取出，并使用脑切片矩阵（Zivic仪器公司，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）将脑组织切成1毫米厚切片，再用内径为1毫米的玻璃巴斯德移液管从切片中punched出腹侧被盖区（vTA）。该解剖方法富集了腹侧被盖区（vTA），但可能也包含部分周围组织。组织穿孔样本被转移至1.5毫升离心管中，在干冰上速冻后储存于−80°C，直至进行RNA或蛋白质测定。在断头后立即采集躯干血，或在第12次饮酒阶段后的慢病毒实验中，在4小时饮酒阶段结束后通过尾静脉使用肝素化毛细管采集血液，用于测量血液酒精浓度（BALs）。血样储存于−80°C，直至进行BALs测定。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-乙醇脱氢酶（ NAD-ADH）酶活性测定

血液酒精水平（BALs）的测定方法如Zapata等人25所述。
对于细胞裂解和去蛋白处理，将10μl全血样本和乙醇标准品与40μl3.4%高氯酸混合，于4°C以2000转/分钟离心6 分钟。取7μl上清液，加入96孔板中的三复孔中。样品在含有2.36μg/ml乙醇脱氢酶（ADH，Sigma‐Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）和0.43mg/ml β‐NAD（ Sigma‐Aldrich公司）的0.43MTris‐HCl缓冲液（pH 8.8）中，室温孵育40分钟。通过检测样品在340纳米处的吸光度来测定β‐NADH的累积量。

定量实时PCR（qPCR）

使用miRNeasy微型试剂盒（凯杰，格曼敦，马萨诸塞州，美国）按照制造商说明提取RNA。取总RNA（80ng/μl）使用高容量cDNA反转录试剂盒（赛默飞世尔科技）进行第一链cDNA合成。定量PCR采用SsoAdvanced通用 SYBRGreen超级混合液（伯乐实验室，赫克莱斯，加利福尼亚州，美国）。参考基因选用Hp rt和Rp l13a。所有基因的引物序列见表1。相对基因表达通过ΔΔ循环定量值（Cq）方法计算。通过分析Th的表达来确定VTA组织富集情况。样本排除标准为经格拉布斯检验识别出的ThCq 值离群值，该情况表明VTA解剖不准确。在96个样本中，有2个因属于离群值而被排除。此外，由于部分样本的总 RNA耗尽，用于检测Wnt1mRNA水平的样本数量较少。

蛋白质印迹

组织在来自细胞信号技术公司（丹弗斯，马萨诸塞州）的50 μl RIPA缓冲液（150mM氯化钠、1.0%IGEPAL®CA‐630、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、50mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.0）中进行匀浆。RIPA缓冲液中添加了赛默飞世尔科技的Halt™磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合液。使用赛默飞世尔科技的双辛可宁酸（BCA）蛋白测定法测定蛋白质浓度。等量的蛋白质（20 μg）进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS‐PAGE）。使用赛默飞世尔科技的Novex™4%至12% Tris‐甘氨酸迷你凝胶、WedgeWell™格式、15孔进行蛋白质分离，并将蛋白质转移至伯乐实验室的硝酸纤维素膜上。膜在含5 %（w/v）脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS，25mMTris‐HCl 和150mM氯化钠）中封闭后，于 4 2, 1 1000, 13497 1 _2157176 °C与
一抗孵育过夜（OTX：Proteintech#‐‐AP，RRID:AB；TH， 1:10,000，Millipore#MAB318，RRID:AB_2201528；以及
β‐肌动蛋白，1:10,000，圣克鲁兹生物技术公司，# sc‐47778，RRID:AB_626632）。然后将膜在室温下与偶联红外（IR）染料的二抗孵育1小时（LI‐COR生物科学公司，美国内布拉斯加州林肯市，IRDye680RD驴抗小鼠IgG，# 925‐68072，RRID:AB_2814912；IRDye800CW驴抗兔 IgG，#925‐32213，RRID:AB_2715510）。使用Odyssey Fc系统（LI‐COR生物科学公司）检测条带，并用Image StudioLite软件（LI‐COR生物科学公司）进行定量。每个样品的蛋白质水平均以β‐肌动蛋白条带的平均密度为基准进行归一化处理。TH条带信号极低或无法检测的样品被排除。

慢病毒生产

使用慢病毒载体pLL3.7产生表达靶向Otx2的短发夹R NA（shRNA）（shOtx2）或非靶向shRNA对照（ shScr）的复制缺陷型慢病毒，该载体由U6启动子表达 shRNA，并由巨细胞病毒（CMV）启动子表达增强型绿色荧光蛋白（GFP）。26 Otx2的23核苷酸靶向序列为5′‐ TTGCAAATGATTGATCAAATATA‐3′，对应于Otx2转录本（Genbank编号NM_001286481.1）的第1549‐1571位。

立体定向手术

使用慢病毒载体（shScr为1 μl的4 × 107 pg/mlp24gag抗原，shOtx2为3 × 107 pg/ml）双侧立体定向递送至腹侧被盖区（vTA），操作步骤如前所述。26,27简而言之，8周龄雄性和雌性C57BL/6J小鼠通过腹腔注射（IP）氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为100和8mg/kg）进行麻醉，并固定于立体定向定位仪（DavidKopf仪器公司，美国加利福尼亚州图洪加）。双侧病毒注射的坐标为：前囟前后方向−3.2mm，内侧/外侧±0.5mm，背侧/腹侧−4.7mm。
病毒以0.2μl/min的速度注射，注射后套管保留额外7分钟以防止病毒回流。在
示意图0

结果

乙醇摄入和血液酒精水平

雄性和雌性小鼠接受了为期4天的间歇性饮酒程序（DID），分别给予乙醇或水（对照），并在最后一次饮酒阶段结束后立即（0小时组）或24小时后实施安乐死，随后分离腹侧被盖区（vTA）用于RNA和蛋白质的检测。乙醇摄入量如图1所示。
在2小时饮酒阶段中，雌性小鼠的乙醇饮用量显著高于雄性小鼠，这与我们之前的观察结果一致28 （图1a，0小时组：性别， F(1,45)= 20.72，P<.0001；时间，F(3,135)= 3.23，P=.024；交互作用，F(3,135)= 0.71，P=.55；图1b，24小时组：性别，F(1,46)= 7.09，P=.011；时间，F(3,138)= 9.24，P <.0001；交互作用，F(3,138)= 3.29，P=.023）。在第四天的4小时饮酒阶段中，雌性小鼠的乙醇摄入量也高于雄性小鼠（0小时组：t(46)= 5.41，P<.0001；24小时组：t(46)= 5.24，P<.0001）。与雌性小鼠更高的乙醇饮用水平一致，其血液酒精水平（BALs）也显著高于雄性小鼠（图1c，雄性： 65.3 ± 16.3mg/dl；雌性：135.0 ± 14.8mg/dl；t(45)= 3.16， P=.003）。在两种性别中，血液酒精水平均与4小时饮酒阶段期间摄入的乙醇量呈显著正相关（图1d，雄性：R2= 0.476， P=.0002；雌性：R2= 0.214，P=.026）。这些结果表明，在间歇性饮酒方案（DIDprotocol）中，雄性和雌性小鼠均摄入了达到醉酒水平的乙醇。

Otx2信使RNA和蛋白质水平在类似暴饮的乙醇摄入后24小时在腹侧被盖区（vTA）升高

最后一次饮酒阶段结束后，与饮用水对照组相比，vTA中 Otx2mRNA水平在乙醇饮用后未发生显著变化（图2a，水，每性别n= 9 ，乙醇，每性别n= 9 ；处理，F(1,32)= 3.93，P=.056；性别，F(1,32)= 0.19，P=.67；交互作用， F(1,32)= 0.59，P=.45）。然而，在第四次饮酒阶段24小时后，乙醇饮用组vTA中的Otx2mRNA水平较对照组升高（图2b，水，每性别n= 12 ，乙醇，雄性n= 12 ，雌性 n= 11 ；处理，F(1,43)= 6.35，P=.016；性别，F(1,43) = 5.64，P=.022；交互作用，F(1,43)= 3.76，P=.059）。
此外，vTA中Otx2的表达存在性别差异，雌性的Otx2水平高于雄性。这似乎是由于饮用乙醇的雌性小鼠中Otx2增加更为明显所致，尽管性别与乙醇的交互作用尚未达到统计学显著性。

腹侧被盖区（vTA）中的OTX2蛋白质水平在饮酒阶段结束后立即检测时，雌性乙醇组高于雄性乙醇组（图2c，雄性水组， n= 12，雄性乙醇组，n= 10，雌性水组，n= 11，雌性乙醇组， n= 11；处理，F(1,40)= 0.99，P=.327；性别，F(1,40)= 2.88， P=.097；交互作用，F(1,40)= 5.17，P=.029；事后Tukey检验，雌性乙醇组对雄性乙醇组，P=.043）。在24小时后
在第四次饮酒阶段，与对照组相比，无论性别如何，饮用乙醇组的OTX2蛋白质水平均较高（图2d，雄性水组n= 9，雄性乙醇组n= 9，雌性水组n= 8，雌性乙醇组n= 8；处理， F(1,30)= 6.11，P=.019；性别，F(1,30)= 0.89，P=.35；交互作用，F(1,30)= 1.27，P=.27）。综上所述，这些数据表明，暴饮水平的乙醇摄入会导致小鼠腹侧被盖区（ vTA）中Otx2转录本和Otx2蛋白水平升高，且这种升高特异性地出现在乙醇饮用阶段结束后的24小时。

类似暴饮的乙醇饮用后腹侧被盖区（vTA）中 Wnt1和Mdk的表达增加

接下来，我们研究了OTX2的两个已知转录靶点Wnt1和 Sema3c的表达是否因暴饮式乙醇摄入水平而发生改变。
Sema3c的转录本水平在饮酒阶段结束后立即或24小时后均未发生变化（数据未显示）。相反，Wnt1的转录本水平在饮酒阶段结束后立即升高（图3a，雄性水组n= 8，雄性乙醇组 n= 7，雌性水组n= 8，雌性乙醇组n= 7；处理，F(1,26)= 7.63，P=.01；性别，F(1,26)= 1.26，P=.27；交互作用， F(1,26)= 0.28，P=.60），并在24小时后恢复至对照水平（图3b，雄性水组n= 12，雄性乙醇组n= 11，雌性水组n = 10，雌性乙醇组n= 9；处理，F(1,38)= 0.24，P=.63；性别，F(1,38)= 0.11，P=.74；交互作用，F(1,38)= 0.02，P=.89）。
因此，暴饮乙醇饮用导致在饮酒阶段结束后立即出现腹侧被盖区（vTA）中Wnt1基因表达增加。

接下来，我们确定了类似暴饮的乙醇消耗是否会影响腹侧被盖区（vTA）中Mdk基因的表达。MDK是一种对多巴胺能神经元存活重要的神经营养因子29,30 ，我们先前已证明Mdk参与乙醇饮用行为24 。值得注意的是，通过使用 JASPAR数据库31 ，我们发现Mdk基因的启动子在转录起始位点上游2798至2791（TTAATCCA）和1063至1056 （GTAATCCT）碱基对处有两个OTX2的共识结合位点，提示Mdk的表达可能受OTX2的转录调控。乙醇饮用在最后一次饮酒阶段结束后立即检测时并未影响MdkmRNA水平（图3c，雄性水组n= 9，雄性乙醇组n= 9，雌性水组 n= 9，雌性乙醇组n= 9；处理，F(1,32)= 0.48，P=.49；性别，F(1,32)= 0.082，P=.78；交互作用，F(1,32)= 1.02，P=.32）。然而，24小时后，乙醇饮用组的 MdkmRNA水平较对照组升高（图3d，
雄性水组n= 12，雄性乙醇组n= 12，雌性水组n= 12，雌性乙醇组n= 11；处理，F(1,43)= 4.14，P=.048；性别，F(1,43) = 1.68，P=.20；交互作用，F(1,43)= 0.037，P=.85)。

最后，我们检测了类似暴饮的乙醇饮用是否会改变腹侧被盖区（vTA）中酪氨酸羟化酶(Th)的基因和蛋白质表达，因为已有证据表明OTX2可以影响TH蛋白水平。14
Th基因表达在任一时间点乙醇饮用后均未发生变化（补充图1）。与mRNA结果一致，TH蛋白水平也未因乙醇消耗而发生改变（补充图1）。这些结果表明，暴饮水平的乙醇摄入（至少持续4天）不会显著影响Th基因和蛋白质水平。
示意图1

降低Otx2表达对小鼠腹侧被盖区类似暴饮的乙醇饮用无影响

由于乙醇饮用后小鼠腹侧被盖区（vTA）中的Otx2蛋白增加，我们接下来确定了vTA中Otx2是否
示意图2

腹侧被盖区（vTA）可能在乙醇摄入中发挥作用。为此，我们使用慢病毒载体通过RNA干扰降低vTA中Otx2的水平。将表达靶向Otx2的短发夹RNA（shOtx2）或对照非靶向shRNA（shScr）以及作为转导细胞报告基因的绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒微量注射到小鼠的vTA中。我们在注射后3周测量了小鼠Otx2转录本的水平，以确定 shOtx2是否降低了vTA中Otx2的表达。从脑切片中分离出转导的vTA区域，提取RNA，并通过定量PCR分析 cDNA中的Otx2mRNA水平。与表达shScr的小鼠相比， vTA中表达shOtx2导致Otx2转录本水平下降~20%（图 4a，雌性shScr组，n= 9，雌性shOtx2组，n= 10，雄性 shScr组，n= 9，雄性shOtx2组，n= 9，t(35)= 2.31，P=.027）。在同一组样本中，shOtx2对ThmRNA水平无显著影响（图4b，t(35)= 0.96，P=.342）。

接下来，小鼠在VTA注射表达shOtx2或shScr的慢病毒，并在手术后3周通过间歇性饮酒方案检测乙醇摄入。实验期间消耗的乙醇
2小时饮酒阶段在表达shOtx2和shScr的小鼠之间没有差异（图 4c，雄性shScr，n= 8，雄性shOtx2，n= 8；shRNA，F(1, 162)= 0.95，P=.33；饮酒阶段，F(11,162)= 2.88，P=.0018；交互作用，F(11,162)= 0.51，P=.83；图4h，雌性shScr，n= 6，雌性shOtx2，n= 6；shRNA，F(1,116)= 0.003，P=.96；饮酒阶段，F(11,116)= 2.51，P=.007；交互作用，F(11,116)= 0.71， P=.72）。我们还测量了每周第四次饮酒阶段持续4小时的乙醇摄入量。与2小时饮酒阶段类似，表达shScr或shOtx2的小鼠在乙醇消耗量上无显著差异（图4d–f，雄性，第4次饮酒阶段， t(14)= 0.67，P=.51；第8次饮酒阶段，t(14)= 1.63，P=.13；第 12次饮酒阶段，t(14)= 1.09，P=.29；图4i–k，雌性，第4次饮酒阶段，t(10)= 0.49，P=.63；第8次饮酒阶段，t(10)= 1.26， P=.24；第12次饮酒阶段，t(10)= 1.97，P=.077）。最后，在第12天4小时饮酒阶段结束后立即测量血液酒精水平，表达 shScr和shOtx2的小鼠之间的血液酒精水平没有差异（图4g，雄性，t(14)= 0.26，P=.80；图4l，雌性，t(10)= 0.57，P=.58）。
综上所述，这些结果表明降低Otx2
示意图3

降低Otx2表达在腹侧被盖区（vTA）不影响蔗糖消耗

尽管减少腹侧被盖区（vTA）中的Otx2并未改变小鼠的乙醇饮用行为，但我们测试了这是否会影响蔗糖摄入量，因为已有研究提示vTA中的Otx2与快感缺失有关。用于乙醇饮用测试的同一批小鼠在完成乙醇饮用测试3天后，接受了为期4天的2%蔗糖溶液摄入测试。在每天2小时的测试阶段中，表达 shScr和shOtx2的小鼠之间对蔗糖溶液的消耗量没有显著差异（图5a，雄性，shRNA，F(1,56)= 0.47，P=.50；天数， F(3,56)= 4.82，P=.0047；交互作用，F(3,56)= 0.09，P=.97；
图5c，雌性，F(1,40)= 0.39，P=.54，天，F(3,40)= 3.81， P=.017；交互作用，F(3,40)= 0.31，P=.82）。在第4天的 4小时阶段中，蔗糖摄入也未见差异（图5b，雄性，t(14)= 0.08，P=.94；图5d，雌性，t(10)= 0.89，P=.39）。

最后，在完成蔗糖饮用测试后，我们通过免疫组织化学方法检测了vTA中的病毒转导情况，并使用酪氨酸羟化酶抗体、绿色荧光蛋白和OTX2抗体测量了OTX2蛋白质水平（图 5e–h）。在注射表达shScr和shOtx2慢病毒的小鼠中，病毒扩散范围在前后方向上为~0.33mm，表明两组间vTA区域的病毒转导程度相当。此外，与shScr组相比，shOtx2组中 GFP阳性细胞的OTX2蛋白水平降低了66%（图5h，shScr组 n= 9只小鼠，shOtx2组n= 10只小鼠，t(17)= 4.2，P=.0006）。酪氨酸羟化酶（TH）方面无显著差异
示意图4

讨论

在这里，我们发现类似暴饮的乙醇饮用会增加成年小鼠腹侧被盖区（vTA）中Otx2mRNA和Otx2蛋白、Wnt1 mRNA以及MdkmRNA的水平。本研究的一个有趣发现是，尽管雌性小鼠的乙醇摄入量高于雄性，但类似暴饮的乙醇饮用所诱导的许多转录和蛋白质变化在雄性和雌性中均出现。这表明，一定阈值剂量的酒精可诱导vTA中的转录变化，且这种变化与性别无关（至少在我们检测的基因范围内）。尽管先前的研究发现胚胎发育期间的乙醇暴露会影响大脑中Otx2的基因表达，但成年小鼠在类似暴饮饮酒后vTA中Otx2表达的变化此前尚未被研究。我们在乙醇饮用阶段结束24小时后观察到OTX2蛋白水平升高，提示乙醇饮用后vTA中OTX2靶基因的转录也可能发生改变。

我们首先测量了乙醇饮用后vTA中已知的OTX2靶基因Wnt1和Sema3c的表达。选择这些基因是因为Peña等人17 发现，在雄性小鼠出生后第10至20天经历母体分离应激会导致vTA中Sema3c和Wnt1基因启动子上的OTX2结合减少，且其表达降低，这表明这些基因的转录活性受OTX2调控。
我们发现，乙醇饮用后Sema3cmRNA水平未发生变化。然而，在第四次饮酒阶段结束后立即检测，饮用乙醇的小鼠 vTA中Wnt1转录本水平升高。Wnt1水平在第四次饮酒阶段结束24小时后恢复至正常水平。这些数据表明，在暴饮阶段vTA中的Wnt1表达被短暂诱导，可能由此导致WNT1蛋白增加。在第四次饮酒阶段结束后立即检测，OTX2蛋白水平并未升高，表明在此时间点OTX2可能并不参与乙醇诱导的Wnt1mRNA水平上升。相反，有可能是WNT1促进了乙醇饮用24小时后观察到的vTA中OTX2的增加，因为已有证据显示WNT1对Otx2的表达存在相互调控。32 β‐ catenin是WNT信号通路的下游介质，可结合到Otx2的启动子区域并调节其表达，32而我们发现Otx2
转录本在24小时时升高。要直接验证这一假设，需要进行实验来测量乙醇饮用后WNT1蛋白水平以及β‐catenin在 Otx2启动子上的结合情况，并通过操控WNT1的表达来确立其在乙醇诱导的Otx2变化中的因果作用。有趣的是，已有研究发现慢性酒精暴露会抑制肝脏中的WNT1/β‐ catenin信号通路，34但在酒精使用障碍背景下，成年大脑中的WNT1信号尚未得到研究。这将是未来研究的一个极佳方向。

我们还发现，在乙醇饮用阶段结束24小时后，腹侧被盖区（vTA）中MdkmRNA水平升高。我们团队先前的研究表明，体外单次乙醇暴露可导致人神经母细胞瘤细胞系中MDK表达增加35 ，并且小鼠Mdk在防止过度乙醇饮用方面发挥作用，因为与对照小鼠相比，Mdk基因敲除小鼠以及在腹侧被盖区（vTA）表达Mdk短发夹RNA的小鼠乙醇摄入量更高24 。我们探讨了Mdk是否可能是 OTX2调控的基因，因为Mdk和Otx2均对多巴胺神经元的发育至关重要10-14,21,29,30。通过计算机模拟分析，我们在 Mdk基因的启动子区域发现了预测的OTX2结合位点，因此乙醇饮用后24小时观察到的Otx2蛋白表达增加可能促进了此时Mdk转录本的增加。确定OTX2是否直接与 Mdk启动子结合将非常重要。如果确实如此，这些数据表明Mdk是腹侧被盖区（vTA）中一个新的乙醇响应性 OTX2靶基因。

因为已有研究显示，在vTA中降低Mdk会增加乙醇摄入量，24我们决定检验降低Otx2水平是否同样会导致乙醇消耗增加的假设。在小鼠的vTA中降低Otx2并未影响乙醇或蔗糖的摄入。对此结果的一种简单解释是，vTA中 OTX2蛋白的减少程度不足以引起行为变化。通过qPCR检测发现，在病毒注射3周后，Otx2转录本水平仅降低了20 %。此外，我们也没有检测shOtx2对Mdk基因表达的影响。
然而，我们在行为测试结束后，对vTA中被病毒感染的单个细胞进行了OTX2免疫反应性的定量分析，发现OTX2蛋白减少了66%，表明shOtx2是有效的。另一种可能是病毒转导未覆盖vTA足够大的区域从而产生效应，尽管我们曾使用该慢病毒载体在vTA中敲低其他基因的表达，并观察到对饮酒行为的双向影响。24,26,36通过IHC还发现vTA 中其他非多巴胺能细胞也存在OTX2蛋白，而本研究所使用的慢病毒理论上可转导所有细胞。如果OTX2在vTA不同细胞类型中的功能具有相反的作用，则可能需要在特定细胞类型中敲低Otx2才能揭示其对乙醇饮用表型的影响。
在vTA中敲低Otx2也可能引发代偿性变化，从而阻止了酒精和蔗糖饮用行为的改变。

另一种可能性是，降低OTX2水平可能使小鼠更容易出现类似暴饮的行为，但需要另一个环境干扰（例如应激源）来显现出对酒精摄入的显著影响。例如，在幼年小鼠 vTA中降低Otx2会使它们在成年期更容易产生应激诱导的抑郁样行为。17另一个相关问题是，在成年vTA中干扰 OTX2可能无效，因为OTX2的活性可能仅在特定发育窗口 17或关键期才需要，这与OTX2在视觉系统关键期可塑性中的已知作用一致。37,38最后，也有可能是vTA中的 OTX2并不参与乙醇摄入的调控。Otx2在中枢神经系统的某些区域表达，可能通过在这些区域的转录活性参与类似暴饮的乙醇饮用。例如，Otx2在内侧缰核中高表达，并调控缰核‐脚间核环路39的发育，该环路参与奖赏与厌恶40 。
Otx2也在脉络丛中强烈表达。41 OTX2蛋白由脉络丛室管膜细胞分泌进入脑脊液，并通过与周围神经网结合被皮层表达小清蛋白的中间神经元摄取41,42 ，从而以非细胞自主方式调节转录。皮层中的OTX2活性也可能影响类似暴饮的饮酒行为。未来的研究应探索OTX2可能发挥作用的其他脑区，以调控暴饮及其他与酒精使用障碍相关的行为。