引物设计的一些规则和小Tips

愿武艺晴小朋友一定得每天都开心！ 

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一般有3个地方得注意哈：

1. 引物设计原则：

• ‌长度‌：引物长度一般在18-30个碱基之间，推荐18-24个碱基。‌1
• ‌Tm值‌：引物的Tm值应接近60℃，上下游引物的Tm值应尽量接近，一般不超过4℃。
• ‌GC含量‌：引物的GC含量应在40%-60%之间，上下游引物的GC含量应接近。‌12
• ‌避免形成二级结构‌：引物设计区域应避开复杂二级结构，避免连续4个以上碱基的互补。
• ‌3'端选择‌：引物3'端避免选择A，最好选择T，以减少错配引发的合成效率差异。‌

2. 评估引物的特异性【这里十分有必要的，我觉得】：

一般我会比较相信：NCBI的BLAST功能中的Primer-BLAST；它给出的结果。

手把手教学——通用荧光定量PCR引物设计的原则和流程 - 知乎 【参考这位博主，写的蛮好的】

比如，给外源蛋白cas9设计的引物，在跟鼠和人自身基因组去blast的时候，是没有匹配区域出现，表示引物是合格的。

3. 湿实验验证：

判断标注：出现特异性的单一条带，表示该对引物是OK的！

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