解锁单细胞奥秘：SCTtransform全解析

解锁单细胞奥秘：SCTtransform全解析

单细胞测序的挑战

在生命科学的微观探索中，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术宛如一把精准的手术刀，为我们剖析细胞异质性提供了前所未有的视角。它能够深入到单个细胞的层面，揭示细胞间微妙而关键的差异，这些差异蕴含着发育、疾病发生发展等重要生命过程的密码 。通过 scRNA-seq，我们可以观察到在同一组织或器官中，不同细胞的基因表达谱呈现出丰富的多样性，这些多样性反映了细胞在功能、状态和分化阶段上的差异。比如在肿瘤研究中，scRNA-seq 能识别出肿瘤组织内具有不同特性的细胞亚群，包括具有干细胞特性的肿瘤起始细胞、对药物产生抗性的细胞等，为理解肿瘤的异质性和攻克癌症难题提供了关键线索；在神经科学领域，它可以帮助我们区分不同类型的神经元以及它们在神经回路中的独特作用，推动对大脑复杂功能的认识。

然而，原始的 scRNA-seq 数据就像未经雕琢的璞玉，面临着诸多挑战。技术噪音如同杂质，干扰着我们对真实生物信号的读取。在测序过程中，由于实验操作、试剂质量、仪器误差等多种因素，会引入各种随机和系统误差，使得检测到的基因表达量与实际情况存在偏差 。例如，背景噪音可能导致原本低表达甚至不表达的基因被错误检测为有表达，而一些真实表达的基因信号则可能被淹没在噪音之中。

测序深度的差异也是一个棘手的问题。不同细胞的测序深度不一致，就好比对不同区域进行拍照时，有的区域像素高、细节清晰，有的区域像素低、模糊不清 。测序深度较低的细胞，许多低表达基因可能无法被检测到，这就如同在一幅模糊的画作中难以辨认细微的笔触，导致我们对这些细胞的基因表达全貌了解不完整，丢失了重要的生物学信息，进而影响后续对细胞类型鉴定、细胞状态分析以及基因调控网络推断的准确性。这些问题使得原始数据在直接用于分析时，就像在迷雾中摸索，难以得出准确可靠的结论，因此，对 scRNA-seq 数据进行标准化处理就显得尤为迫切和必要，它是我们拨开迷雾、洞察细胞奥秘的关键一步。

认识 SCTtransform

SCTtransform 是一款在单细胞转录组数据分析领域极具影响力的工具，由 Christoph Hafemeister 在拉胡尔・萨蒂亚实验室精心打造 ，其相关研究成果发表在《Genome Biology》上，为单细胞测序数据的处理带来了革新性的方法，核心是基于正则化负二项回归 。在单细胞 RNA 测序实验中，不同细胞的基因表达计数数据呈现出复杂的特征，不仅存在细胞间的生物学差异，还受到多种技术因素的干扰。SCTtransform 通过构建正则化负二项回归模型，将基因表达计数作为响应变量，把细胞特异性的测序深度、基因特异性的平均表达水平等作为解释变量，在模型中通过正则化项对回归系数进行约束，防止过拟合，从而有效地区分技术噪音和真实的生物学信号，实现对数据的标准化和方差稳定化处理。

SCTtransform 提供了两种工作模式，为用户在不同场景下的数据分析提供了灵活选择 。原始版本凭借其经典的算法框架，在处理常规单细胞数据时表现出色，能够准确地校正细胞间的计数差异，有效去除技术噪音，为下游分析提供稳定可靠的数据基础。而 v2 版本则在多个方面进行了优化升级，引入了更先进的参数估计方法，大大提高了计算效率和内存使用效率，能够更精准地识别可变特征，显著提升了下游差异表达分析的效能，尤其适用于大规模复杂单细胞数据集的分析，为科研人员深入挖掘数据背后的生物学信息提供了更强大的支持 。

在单细胞分析流程中，SCTtransform 占据着举足轻重的地位，是连接原始数据与后续深度分析的关键桥梁 。在数据预处理阶段，它如同一位精细的工匠，对原始的单细胞测序数据进行雕琢，去除数据中的瑕疵 —— 技术噪音，使数据更加纯净，为后续分析奠定坚实基础。经过 SCTtransform 标准化处理后的数据，能够更真实地反映细胞间的生物学差异，在细胞类型鉴定中，基于标准化后的数据，研究人员可以更准确地根据基因表达特征识别出不同的细胞类型，挖掘出稀有的细胞亚群，这对于理解组织的复杂构成和功能具有重要意义；在细胞状态分析中，能够敏锐地捕捉到细胞在不同生理病理条件下的状态变化，为揭示疾病的发生发展机制提供关键线索；在基因调控网络推断中，标准化的数据能更准确地反映基因之间的调控关系，助力构建更精确的基因调控网络模型，深入理解细胞内的分子调控机制。

SCTtransform 的优势

强大的校正能力

在单细胞数据分析中，对测序深度的校正以及消除其他干扰因素至关重要，SCTtransform 在这方面展现出卓越的性能 。与传统的 log 标准化相比，SCTtransform 对测序深度的校正效果更为出色 。在一项关于小鼠大脑单细胞测序的研究中，研究人员分别使用 log 标准化和 SCTtransform 对数据进行处理。log 标准化后的基因表达数据，仍然存在明显的与测序深度相关的偏差，高测序深度的细胞中，许多基因的表达量被高估，而低测序深度的细胞则存在基因表达量低估的情况，这使得在后续分析中，难以准确区分细胞类型和状态。而经过 SCTtransform 处理后的数据，成功校正了测序深度的差异，基因表达量与测序深度之间的相关性显著降低，能够更真实地反映细胞的内在生物学特性。

同时，SCTtransform 还能有效矫正线粒体、细胞周期等因素对基因表达的影响 。线粒体基因的表达水平常受到细胞生理状态和实验操作的影响，可能会干扰对核基因表达的分析。在对免疫细胞的单细胞测序研究中，SCTtransform 通过对线粒体基因表达的校正，去除了线粒体相关的技术噪音，使得免疫细胞亚群的基因表达特征更加清晰，有助于准确识别不同功能的免疫细胞亚群。在细胞周期方面，处于不同周期阶段的细胞，基因表达谱会存在差异，这种差异可能掩盖细胞间的真实生物学差异 。SCTtransform 能够通过建模，将细胞周期相关的基因表达变化与其他生物学信号区分开来，在对肿瘤细胞的研究中，SCTtransform 校正了细胞周期对基因表达的影响后，研究人员成功发现了一些与肿瘤恶性程度相关的新基因标记，为肿瘤的诊断和治疗提供了新的靶点。

功能集成

SCTtransform 极大地简化了单细胞数据分析流程，它一个函数即可替代 NormalizeData、ScaleData、FindVariableFeatures 三个函数 。在传统的单细胞分析流程中，研究人员需要依次调用 NormalizeData 进行数据归一化，以消除细胞间测序深度的差异；使用 ScaleData 对归一化后的数据进行缩放，使其符合正态分布，便于后续的统计分析；通过 FindVariableFeatures 识别出具有高变异性的基因，这些基因对于区分不同细胞类型和状态至关重要 。这一系列操作不仅繁琐，而且需要对每个函数的参数进行细致调整，增加了分析的复杂性和出错的可能性。

而 SCTtransform 将这三个关键步骤集成在一个函数中，用户只需简单设置参数，即可完成复杂的数据预处理过程 。在对人外周血单核细胞的单细胞测序数据分析中，使用传统流程进行数据处理，研究人员需要花费大量时间和精力在三个函数的参数优化和结果整合上，并且由于不同函数之间的衔接问题，可能导致数据信息的丢失或偏差 。而采用 SCTtransform，研究人员只需一行代码，就能快速完成数据的标准化、缩放和可变基因的识别，大大提高了分析效率，同时保证了数据处理的一致性和准确性，使得研究人员能够更专注于数据背后的生物学意义挖掘。

提升信噪比与发现稀有细胞

在单细胞测序数据中，信 / 噪比的改善对于准确分析细胞的基因表达特征至关重要，SCTtransform 在这方面具有显著优势 。原始单细胞测序数据中，技术噪音常常掩盖了真实的生物学信号，导致基因表达的检测出现误差，影响对细胞状态和功能的判断 。SCTtransform 通过其独特的正则化负二项回归模型，能够有效过滤掉技术噪音，增强真实生物学信号的强度，从而显著改善信 / 噪比 。在对植物单细胞测序数据的分析中，SCTtransform 去除了因实验环境和技术操作引入的噪音，使得植物细胞在不同发育阶段的基因表达变化得以清晰呈现，研究人员能够更准确地解析植物细胞的发育调控机制。

对于发现稀有细胞，SCTtransform 也发挥着重要作用 。稀有细胞在生物体内含量极少，其基因表达特征容易被大量普通细胞的信号所淹没，传统分析方法往往难以有效识别 。SCTtransform 改善后的信 / 噪比，使得稀有细胞的独特基因表达模式能够凸显出来，增加了发现稀有细胞的可能性 。在肿瘤微环境的研究中，存在一些具有干细胞特性的稀有肿瘤细胞，它们在肿瘤的发生、发展和转移中起着关键作用，但由于数量稀少，很难被检测到。SCTtransform 处理数据后，成功捕捉到了这些稀有肿瘤干细胞的基因表达特征，为深入研究肿瘤的异质性和靶向治疗提供了关键线索，有助于开发更精准有效的肿瘤治疗策略。

应用场景

神经科学

在神经科学领域，SCTtransform 发挥着不可替代的重要作用 。大脑是一个高度复杂的器官，其中包含着种类繁多的神经元和神经胶质细胞，它们在结构和功能上相互协作，构成了复杂的神经回路，支撑着大脑的各种高级功能 。准确鉴定不同类型的神经元和神经胶质细胞，是理解大脑功能和神经系统疾病发病机制的基础 。

SCTtransform 能够对大脑单细胞测序数据进行精准分析，帮助研究人员根据基因表达特征，清晰地识别出不同类型的神经元 。在对小鼠大脑海马体的单细胞测序研究中，通过 SCTtransform 处理数据，研究人员成功鉴定出了锥体神经元、中间神经元等多种神经元类型，并且进一步细分出了不同亚型的锥体神经元，如 CA1、CA2、CA3 区的锥体神经元，它们在基因表达、形态结构和功能特性上都存在差异 。对于神经胶质细胞，SCTtransform 同样表现出色，能够区分星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞等不同类型 。星形胶质细胞在维持神经元的微环境稳定、提供营养支持等方面发挥着重要作用；少突胶质细胞则主要负责形成髓鞘，绝缘神经纤维，加速神经冲动的传导；小胶质细胞作为大脑中的免疫细胞，参与免疫防御和神经炎症反应 。通过 SCTtransform 准确识别这些神经胶质细胞，有助于深入研究它们在神经系统发育、正常功能维持以及疾病发生发展过程中的作用 。

免疫学

在免疫学领域，SCTtransform 为免疫细胞状态的分析以及免疫反应机制的探索提供了强大助力 。免疫系统是人体抵御病原体入侵的重要防线，其中免疫细胞种类繁多，包括 T 细胞、B 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，它们在免疫应答过程中各司其职，相互协作，共同维护机体的免疫平衡 。

SCTtransform 能够深入分析免疫细胞的单细胞测序数据，精确剖析不同免疫细胞的状态 。在对 T 细胞的研究中，SCTtransform 可以区分出不同亚型的 T 细胞，如辅助性 T 细胞（Th）、细胞毒性 T 细胞（Tc）、调节性 T 细胞（Treg）等 。Th 细胞又可进一步细分为 Th1、Th2、Th17 等亚型，它们分泌不同的细胞因子，发挥不同的免疫调节作用 。Th1 细胞主要分泌干扰素 -γ 等细胞因子，参与细胞免疫，对抗细胞内病原体感染；Th2 细胞分泌白细胞介素 - 4 等细胞因子，介导体液免疫，主要针对寄生虫感染和过敏反应；Th17 细胞分泌白细胞介素 - 17 等细胞因子，在炎症反应和自身免疫性疾病中发挥重要作用 。通过 SCTtransform 对这些 T 细胞亚型的准确识别和状态分析，研究人员能够深入了解它们在免疫应答中的动态变化和相互作用机制 。

在探索免疫反应机制方面，SCTtransform 也发挥着关键作用 。在对感染性疾病的研究中，利用 SCTtransform 分析感染不同阶段免疫细胞的基因表达变化，研究人员可以揭示免疫细胞如何被激活、分化，以及它们如何协同作用来清除病原体 。在对肿瘤免疫的研究中，SCTtransform 有助于分析肿瘤微环境中免疫细胞的组成和状态，探索肿瘤细胞如何逃避免疫监视，以及免疫治疗如何重塑肿瘤免疫微环境，为开发更有效的肿瘤免疫治疗策略提供理论依据 。

癌症研究

在癌症研究中，SCTtransform 是探索肿瘤细胞异质性和挖掘稀有细胞群体的有力工具 。肿瘤细胞异质性是癌症治疗面临的重大挑战之一，同一肿瘤内部的细胞在基因表达、代谢、增殖能力、转移潜能等方面存在显著差异 。这种异质性导致肿瘤细胞对治疗的反应各不相同，使得癌症治疗难以达到理想效果 。

SCTtransform 通过对肿瘤单细胞测序数据的深入分析，能够精准研究肿瘤细胞异质性 。在对乳腺癌的研究中，SCTtransform 可以识别出不同分子亚型的肿瘤细胞，如管腔 A 型、管腔 B 型、HER2 过表达型和基底样型等，这些亚型在基因表达特征、预后和治疗敏感性上都存在差异 。管腔 A 型乳腺癌通常预后较好，对内分泌治疗敏感；而基底样型乳腺癌预后较差，对传统化疗和内分泌治疗的反应不佳，但可能对靶向治疗或免疫治疗更敏感 。通过 SCTtransform 准确鉴定这些肿瘤细胞亚型，有助于医生为患者制定更精准的个性化治疗方案 。

挖掘肿瘤干细胞等稀有细胞群体也是癌症研究的关键方向 。肿瘤干细胞是肿瘤细胞中具有自我更新和多向分化能力的一小部分细胞，它们在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着关键作用 。然而，肿瘤干细胞数量稀少，且其基因表达特征容易被大量普通肿瘤细胞所掩盖，传统分析方法很难有效识别 。SCTtransform 凭借其卓越的信 / 噪比改善能力，能够成功捕捉到肿瘤干细胞独特的基因表达模式 。在对白血病的研究中，SCTtransform 帮助研究人员发现了白血病干细胞的特异性基因标记，这些标记为白血病的早期诊断、靶向治疗和预后评估提供了新的靶点，有望推动白血病治疗取得重大突破 。

与其他技术的对比

与传统标准化方法对比

在单细胞测序数据处理的浩瀚星空中，SCTtransform 宛如一颗璀璨的新星，与传统标准化方法相比，绽放出独特而迷人的光彩。传统标准化方法中，全局 scale 归一化方法，如 lognormalize 标准化，凭借其简洁直观的原理，在早期单细胞数据分析领域占据了一席之地 。它通过确定单个细胞的 “大小因素”，对每个细胞进行统一缩放，试图将技术噪音与生物细胞间的变异性区分开来 。这种方法基于一个假设，即数据集中所有细胞的潜在 RNA 含量是恒定的，并且可以对所有基因应用单个缩放因子 。然而，现实中的单细胞数据复杂多变，这个假设往往难以成立。

在实际应用中，全局 scale 归一化方法的局限性逐渐显露 。由于它对所有基因采用相同的缩放因子，无法精准地考虑到不同基因的独特表达特性 。一些低表达基因可能在缩放过程中被过度压缩，导致关键信息丢失；而高表达基因则可能因缩放不当，掩盖了其在不同细胞间的真实表达差异 。就像用一把固定尺码的尺子去衡量所有物体，对于大小差异悬殊的物体，很难准确测量其真实尺寸。而 SCTtransform 则另辟蹊径，采用正则化负二项回归模型对单细胞 UMI 表达数据进行建模 。它能够针对不同的基因，学习基因集特定的特征，分别对低、中和高表达基因进行处理，有效消除技术变异的影响，同时最大程度地保留真正的生物异质性 。在对小鼠胚胎发育的单细胞测序研究中，SCTtransform 准确地捕捉到了不同发育阶段细胞中基因表达的细微变化，成功鉴定出多种细胞亚型，而传统的全局 scale 归一化方法却因无法有效处理基因表达的复杂特征，遗漏了许多关键的细胞亚型信息 。

整合分析中的表现

在整合分析的舞台上，SCTtransform 与其他工具携手共舞，展现出卓越的性能 。以与 harmony 等工具进行批次整合为例，SCTtransform 为后续的整合分析奠定了坚实的基础 。在一项关于不同实验室来源的人外周血单核细胞单细胞测序数据的整合研究中，研究人员首先对数据分别进行处理 。未使用 SCTtransform 时，直接结合 harmony 进行批次整合，不同实验室数据之间的批次效应明显，在 UMI 降维可视化图中，来自不同实验室的细胞各自聚集，难以有效融合，严重干扰了对细胞类型和状态的准确分析 。

而当使用 SCTtransform 对数据进行标准化处理后，再结合 harmony 进行批次整合，效果发生了显著的变化 。从可视化图表中可以清晰地看到，不同实验室来源的细胞在降维空间中紧密聚集，批次效应得到了有效消除，细胞类型和状态的分布更加清晰 。这是因为 SCTtransform 通过对测序深度、基因表达水平等因素的精确校正，使得不同批次数据在同一尺度上进行比较，为 harmony 等工具更好地发挥整合作用提供了优质的数据基础 。在对肿瘤样本的多批次单细胞测序数据整合分析中，SCTtransform 同样表现出色，帮助研究人员成功识别出肿瘤细胞的异质性特征和稀有细胞群体，为肿瘤的精准诊断和治疗提供了有力支持 。

使用教程（以 Seurat 包为例）

安装与加载

在 R 环境中安装 sctransform 包及相关依赖包，可使用以下代码：

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))

    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install(c("Seurat", "sctransform"))

安装完成后，加载所需的 R 包：

library(Seurat)

library(sctransform)

数据准备

读取单细胞数据并创建 Seurat 对象，以下以 10X Genomics 格式数据为例：

\# 读取10X数据，data.dir参数指定存放文件的路径

seurat\_data <- Read10X(data.dir = "./data/your\_10x\_data")

\# 创建Seurat对象，project指定项目名称，min.features和min.cells分别设置最小特征数和最小细胞数

seurat\_obj <- CreateSeuratObject(counts = seurat\_data, project = "your\_project", min.features = 200, min.cells = 3)

计算线粒体基因比例，这一步对于评估细胞质量和后续的数据校正非常重要：

\# 计算线粒体基因比例并存储在对象元数据中

seurat\_obj\[\["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(seurat\_obj, pattern = "^MT-")

SCTtransform 标准化

使用 SCTransform 函数进行标准化，该函数将替代传统流程中的 NormalizeData、ScaleData、FindVariableFeatures 三个函数：

\# 运行SCTtransform，vars.to.regress指定要校正的干扰因素，这里以线粒体基因比例为例

seurat\_obj <- SCTransform(seurat\_obj, vars.to.regress = "percent.mt", verbose = FALSE)

在上述代码中，vars.to``.regress参数用于指定在标准化过程中需要校正的干扰因素 。比如，当我们关注线粒体基因表达对其他基因表达的影响时，将percent.mt作为回归变量，SCTtransform 会在建模过程中考虑并校正这一因素，从而使数据更加纯净，减少因线粒体基因表达差异带来的技术噪音，让后续分析更能反映细胞真实的生物学状态 。如果还有其他已知的干扰因素，如细胞周期相关基因的表达水平，也可以添加到vars.to``.regress参数中，如vars.to``.regress = c("``percent.mt``", "cell_cycle_genes")，以进一步优化标准化效果 。

降维与聚类

进行 PCA 降维，以提取数据的主要特征：

seurat\_obj <- RunPCA(seurat\_obj, verbose = FALSE)

使用 UMAP 进行非线性降维，以更好地可视化细胞的分布：

seurat\_obj <- RunUMAP(seurat\_obj, dims = 1:30, verbose = FALSE)

进行聚类分析，确定细胞亚群：

seurat\_obj <- FindNeighbors(seurat\_obj, dims = 1:30, verbose = FALSE)

seurat\_obj <- FindClusters(seurat\_obj, verbose = FALSE)

最后，使用 DimPlot 函数可视化降维与聚类结果：

DimPlot(seurat\_obj, reduction = "umap", label = TRUE)

通过上述步骤，我们可以完成基于 SCTtransform 的单细胞数据分析流程，从原始数据处理到最终的细胞亚群鉴定和可视化 。在实际应用中，用户可以根据具体的研究问题和数据特点，灵活调整参数设置，以获得更准确、更有生物学意义的分析结果 。

发展趋势与展望

展望未来，SCTtransform 在单细胞研究领域的发展前景一片光明，其将在多个维度持续创新，引领单细胞测序数据分析的新潮流 。

在技术融合方面，SCTtransform 有望与新兴单细胞技术紧密结合，碰撞出绚丽的火花 。与单细胞多组学技术的融合将成为重要趋势，单细胞多组学技术能够同时对单个细胞的多种组学信息进行分析，如基因组、转录组、表观基因组、蛋白质组等 。SCTtransform 可以在处理单细胞转录组数据的基础上，整合其他组学数据的信息，构建更全面、更准确的细胞分子图谱 。在肿瘤研究中，结合单细胞转录组和单细胞表观基因组数据，SCTtransform 能够从基因表达和表观遗传修饰两个层面，深入解析肿瘤细胞的异质性和恶性转化机制，为肿瘤的精准诊断和治疗提供更丰富的靶点和策略 。与空间转录组技术的结合也极具潜力，空间转录组技术能够保留细胞在组织中的空间位置信息，SCTtransform 可以对空间转录组数据进行标准化处理，结合基因表达和空间位置信息，研究细胞在组织微环境中的相互作用和功能，这对于理解胚胎发育、神经退行性疾病等过程中细胞的空间分布和功能具有重要意义 。

在算法优化上，SCTtransform 也将不断演进 。随着机器学习和人工智能技术的飞速发展，将这些前沿技术融入 SCTtransform 的算法中，能够进一步提升其性能 。利用深度学习算法自动学习单细胞数据中的复杂模式和特征，实现更精准的技术噪音去除和生物学信号提取 。开发更高效的计算方法，以应对日益增长的大规模单细胞数据集，降低计算资源的需求和分析时间，提高数据分析的效率，使科研人员能够更快速地从海量数据中获取有价值的信息 。

在应用拓展方面，SCTtransform 将在更多领域发挥重要作用 。在再生医学中，研究人员可以利用 SCTtransform 分析干细胞分化过程中的单细胞转录组数据，深入了解干细胞向不同细胞类型分化的分子机制，为干细胞治疗提供理论支持和技术指导 。在药物研发领域，SCTtransform 能够帮助研究人员分析药物处理后细胞的基因表达变化，筛选出潜在的药物靶点和生物标志物，评估药物的疗效和毒性，加速药物研发的进程 。在农业领域，分析植物单细胞转录组数据，有助于揭示植物生长发育、抗逆性等过程的分子机制，为培育优良品种、提高农作物产量和质量提供科学依据 。可以预见，SCTtransform 将在单细胞研究领域持续闪耀，为生命科学的发展注入源源不断的动力，助力我们解开更多生命的奥秘 。