蛋白质免疫印迹（Western Blot）常见问题及解决方案

1.为什么检测不到目标蛋白？

样本中不存在目标蛋白；蛋白质被降解掉了，需要加入PMSF，抑制蛋白酶活性；抗体不能识别目标蛋白，检查抗体信息，抗体选择是否正确，能否用于WB验证。

2.蛋白分子量小于10KD怎么做WB？

尽量选择0.2μm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在一起再电转。

3.WB检测显示无特异性条带是什么原因？

（1）抗体的原因：检查一抗种属是否正确，二抗是否匹配一抗，抗体孵育时间和用量是否合适；

（2）蛋白的原因：蛋白上样量少，需增加上样量；

（3）转膜的原因：转膜不能过度，蛋白分子量小需适当降低转膜电压或时间；

（4）洗膜或封闭的原因过度：如洗膜过度，则需要降低洗膜次数；适当更换或降低封闭剂浓度，减少封闭时间；可尝试更换抗体稀释液；

4.有条带但是高背景该如何处理？

（1）原因：封闭不充分。解决方法：更换新鲜的封闭液，延长封闭时间。

（2）原因：洗涤不充分。解决方法：增加洗涤次数及时间。

（3）原因：一抗浓度过高。解决方法：稀释抗体至合适浓度。

（4）原因：样品有问题。解决方法：检查蛋白样品的纯度和质量，建议使用新鲜样品。

5.信号弱或完全缺失怎么办？

（1）原因：转膜不充分。解决方法：检查蛋白转移的效率和时间是否正确。

（2）原因：一抗不识别检测物种的蛋白。解决方法：比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。

（3）原因：一抗和二抗不匹配。解决方法：检查一抗和二抗的种属，二抗需和一抗宿主的物种相同。

（4）原因：抗原量不足。解决方法：每个泳道蛋白上样量不低于20-30 μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。

6.条带拖尾怎么办？

 可能是样品溶解的不好，需充分溶解混匀后上样；可能存在一定程度地蛋白降解，要尽量使用新鲜样本。

7.为什么胶图背景有不均匀的黑色斑点？

封闭液未完全溶解，会使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点，封闭液要充分溶解，封闭之后用TBST清洗三遍再加一抗。

8.出现多条非特异性条带或条带位置不对如何处理？

 可能是表达的蛋白样本具有多种修饰形式，如乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等，可以使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正常的大小。