重组蛋白表达——可溶性表达

重组蛋白表达——可溶性表达

来源：Frdbio丨 发布时间： 2019-07-16 17:07:53丨 17513人浏览

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1.表达工程菌

 蛋白可溶性表达很大原因取决于二硫键和正确折叠的问题，所以选用利于二硫键形成的宿主菌，如Origami(DE3), Origami B(DE3),Rosetta Origami(DE3) 等更利于蛋白表达。

2.促溶标签

 前文的列表中已经详细列出，并简要介绍功能特点，值得注意的是选用促溶标签时，一定要考虑载体情况和表达工程菌的配合，如Trx标签主要是促进二硫键的配对，必须配合Origami(DE3)之类的工程菌使用，如果使用BL21(DE3)通常不会使目标蛋白的可溶性得到改善。

3.分子伴侣表达

 在表达工程菌内同时装入一个表达伴侣蛋白的表达质粒，表达伴侣蛋白的质粒必须与表达外源蛋白的质粒避免“质粒不相容性”。目前，常用于大肠杆菌表达的分子伴侣主要是DNak(DnaJ,GrpE)和GroEL(GroES)等，科研人员可根据自己的实验需要构建合适的分子伴侣质粒，含分子伴侣质粒的感受态细胞已经有商业化的产品BL21(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)系列,实验人员可以根据具体情况选购。

4.启动子选择

 载体的启动子对于可溶性表达影响至关重要，pET系列的 T7/T7 lac为强启动子，强启动子在提高蛋白产量的同时也增强了包涵体的形成，如果遇到此种情况可以考虑换用弱启动子的载体，如pGEX系列，还可选择含cspA启动子的pCold系列载体。

5.分泌性表达

将外源目标蛋白分泌表达到培养基中，实现这个功能需要将原核蛋白信号肽序列加到外源蛋白的上游即可；目前，福因德生物已经开发出pFRD-pelB系列载体，可以帮助实现在大肠杆菌中分泌表达。

6.培养条件的优化

最常用的优化条件为：诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间；还可以优化培养基的营养成分和离子物质，比如，我们使用营养成分稍低的LB培养基，可同时向培养基中添加葡萄糖，镁离子、氯化钠、硫酸铵等盐离子。

6.1 低温诱导:比如20℃,低温情况下,转录和翻译变慢,蛋白质浓度低,有更多的时间正确折叠；

6.2 向培养基中加入0.4M蔗糖，高渗引起了渗透性休克反应，该反应增加了细胞内谷氨酸、脯氨酸和海藻糖的水平，为蛋白的正确折叠提供了环境；

6.3 42℃短暂热休克，然后降温到20℃：热休克增加了DnaK/J和GroEL/ES的水平，通常的程序是37℃培养到A600nm=0.5,然后快速升温到42℃维持15min左右，然后降到20℃并诱导蛋白的表达。

6.4 自诱导培养基，适合于T7启动子系列的诱导表达，当工程菌增长到一定密度后，自己缓慢开启诱导开关，缓慢诱导蛋白表达，利于蛋白正确折叠，便于可溶性表达。

AutoExp原核培养基(自诱导添加剂）PER0020