【原核表达】信号肽与可溶性分泌表达

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信号肽能够帮助蛋白完成转运、调节蛋白质的翻译速度，使其有更多机会正确折叠、后加工成有活性蛋白。大肠杆菌所谓的分泌表达通常是指蛋白质转运到细胞周质中，即细胞外膜和内膜之间的腔隙内，再进一步转运到细胞膜外培养基中，通常也就是两步分泌；如果不能实现第二步，那就只能停留在细胞周质中。大部分蛋白转移到周质都能实现更好的二硫键氧化和蛋白折叠，获得比较高活性的蛋白。没有直接分泌到培养基中的蛋白也不是件坏事，或许更利于收集纯化。

外源重组蛋白在大肠杆菌表达时，常常容易形成包涵体，主要原因是重组蛋白表达位于细胞质中，细胞质中为强还原环境，不利于二硫键的生成，并且缺少二硫键生成所需要的酶；而细胞周质的环境非常适合重组蛋白的二硫键生成和正确折叠（二硫键氧化还原酶和肽脯氨酰异构酶）,并且周质空间不大，可储存的蛋白质不多，可让蛋白质在这里“细嚼慢咽”慢慢加工正确折叠。所以，要想实现重组蛋白二硫键正确折叠，表达出有活性的蛋白，通常有两个策略：（1）通过基因工程改造出细胞质为氧化性环境的工程菌株，同时细胞质中还要有二硫键形成所必须的酶类；（2）将重组蛋白转运到细胞周质中，要有中介介导重组蛋白穿膜，这个中介就是信号肽。

信号肽(signal peptide，SP)是一段15-30个氨基酸序列短肽，融合在蛋白质N-端，通常是疏水性的，其作用是引导蛋白转运到细胞周质中。按照结构和功能划分，可以分为三个区：N区、H区和C区。

信号肽与分泌转运途径

讲到信号肽，我们先讲分泌途径的转运，也就是将蛋白前体或半加工蛋白从细胞质转运到周质中的途径。大肠杆菌中存在三种分泌途径：一般分泌途径(general secretory pathway，Sec)、信号识别颗粒(signal-recognition particle，Srp)途径和双精氨酸转运(twin-arginine translocation，Tat)途径。这三种转运途径需要不同信号肽配合不同的转运元件完成蛋白质由细胞质到周质空间的转运。

信号肽在转运途径中的工作原理：信号肽被其中某个转运元件识别，再借助于其他的转运元件将蛋白前体或者经过初步折叠的蛋白转运到细胞周质，在细胞周质中，信号肽C区被信号肽酶识别，将信号肽切除；在细胞周质氧化性环境中，二硫键氧化酶帮助完成蛋白质二硫键形成和蛋白质折叠。大多数原核生物信号肽SPase识别的关键位置为信号肽C-端的1和3处位氨基酸，也称之为(-3, -1)规则，C区多以极性氨基酸为主。

1. Sec途径

Sec分泌途径是大肠杆菌蛋白转运最主要的途径之一，蛋白质翻译完成后尚未完成后加工（折叠或者半折叠）时就被转运至细胞周质，这个途径需要很多因子，比如SecA、SecB、SecD、SecF、SecY、SecE、SecG等配合，当然还需要触发因子辅助。整个过程分为三个步骤：介导、转运和释放（折叠），首先SecA识别信号肽与其结合，紧接着SecB再结合上去，SecB具有分子伴侣作用，可以让复合物保持更好的水溶性状态；与此同时，SecY、SecE和SecG组成SecYEG跨膜通道嵌入在细胞质膜中欢迎复合物通过到达细胞周质，SecD、SecF组成复合体SecDF，起到一个质子泵的作用，起到提供能量加油助威的作用。蛋白转运到细胞周质后，信号肽被信号肽酶(signal peptidase，SPase)切除，前体蛋白再经过一系列加工成为成熟蛋白。

Sec 分泌途径信号肽N区通常含有3-5个带正电荷的氨基酸，通过磷酸骨架与SecB结合；H区由7-15个氨基酸组成，通过输水左右与SecA结合；C区是信号肽酶识别位点，信号肽酶识别后将信号肽切除。

2.Srp途径

Srp转运途径与Sec转运途径稍有不同，这个转运途径中有个转运元件叫做信号识别颗粒(signal- recognition particle，SRP)，蛋白前体正在转录的时候，SRP就迫不及待地迎上去与其结合，接着膜受体Fts又结合上去，这样就形成核糖体-蛋白前体肽-SRP-FstY复合物，然后通过SecYEG复合体通道进入到细胞周质腔内，这种转运方式也叫共翻译转运，与Sec途径相同点都是通过SecYEG复合体通道进入到细胞周质腔内，信号肽C区是信号肽酶识别位点被切除，完成蛋白质加工。

Srp转运途径与Sec转运途径信号肽结构相似。

3.Tat途径

Tat转运途径与以上两种不同，这种途径又称翻译后转录，蛋白完成部分折叠；这种途径是一种小众途径，但其对生命活动至关重要，主要参与呼吸和有机磷代谢等。转运过程是这样的，翻译后的蛋白前体在细胞质内在分子伴侣盒触发因子的作用下完成初步加工折叠；与此同时，TatB和TatC相结合形成复合物，当Tat信号肽靠近TatBC复合物的时候，TatC识别双精氨酸序列，接着TatB与信号肽结合，并且召唤来TatA,他们仨组成一个“拱形门”TatBC-TatA通道，让其顺利通过，通过后信号肽酶识别信号肽将其切除，完成蛋白质加工。

Tat信号肽的命名源自于N区末端和H区前端之间有一段S/T-R-R-X-F-L-K保守序列，这是Tat信号肽主要特征。

三种分泌转运途径对应的信号肽结构特点

下图为三种转运途径所对应的信号肽结构比较，图片来源于文献[1],感兴趣的读者可以进一步查阅原文。

大肠杆菌信号肽很多，常见的有来源于大肠杆菌自身的蛋白如外膜蛋白(outer membrane protein，OmpA)，存在于周质空间的二硫化物氧化还原酶(thiol disulfide oxidoreductase，DsbA)，大肠杆菌代谢调控转运的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，PhoA)[7]，还有有源于其他菌种分泌的胞外蛋白，如来自胡萝卜软腐欧文氏菌的果胶裂解酶(pectate lysate from Erwinia carotovora，PelB)。

信号肽使用案例：

下图表格为使用信号肽进行大肠杆菌重组蛋白表达的成功案例和有益效果

信号肽的选用：

信号肽带来的有益效果上文已经反复提及，但是信号肽也不实万能的，并且也没有通用的信号肽可以应对所有蛋白。一个好的信号肽不到可以促进转录翻译，而且可以很好地控制蛋白翻译、加工和转运的速率，不致于让蛋白前体积压形成包涵体。

那么我们怎样去选择和使用信号肽呢？目前有个信号肽数据库可供查询：signal peptide website (http://www.signalpeptide.de/)，从这刻库里选出的信号肽可以通过评测分析，选择最优的使用。当然，生物学实验是一门实践性很强的学科，计算机分析的数据也只能仅供参考。