必收藏：代谢组学22问22答

代谢是维持各项基础生命活动的物质基础，参与了能量转化、物质合成和分解等关键生命活动。代谢组学是系统生物学的重要组成部分，是最接近表型的一门学科。代谢组学通过对不同生理周期或外界刺激下机体的所有代谢产物进行定性和定量分析，以寻找出目标差异代谢物，可用于疾病机理研究、疾病早期诊断、药物靶点发现等。在代谢组学研究中，大家或许会遇到关于代谢组学取样、样本保存、实验方法、研究思路等问题。因此，本期伯小医特意汇总了代谢组学常见问题与解答，希望能够为大家提供一些帮助！

01 与其他组学相比，代谢组学有哪些优势？

与基因组学、转录组学、蛋白质组学相比，代谢组学具有数据量低、易于检测、分析简单、放大效应、终端效应、通用性高等优点。

02  代谢组产品样本量及生物学重复要求多少？

 

注意：（1）生物学重复太少，会导致后期建模效果较差，满足条件的差异代谢物数量较少，甚至无法进行统计学分析。

（2）样本需干冰寄送。

03 生物学重复是什么意思？技术重复是什么意思？

（1）生物学重复就是针对不同的生物个体或来源不同的样本进行完全相同的实验处理。如采集编号为1的小鼠血浆为第一个生物学重复，采集编号2的小鼠血浆则为第二个生物学重复。

（2）技术性重复是指在同一个生物样本上使用相同的实验技术、仪器设备，在短时间内进行多次重复的实验操作。技术性重复包括完全技术重复和部分技术重复两种情况，完全技术重复即整个实验过程重复操作，部分技术重复指只是部分实验步骤重复，如提取液上机3次。如采集编号为1的小鼠血浆，然后分成3管，要求对这3管分别提取、检测，这3管就是一个完全技术重复。如果只是提取1次，然后将提取液上机3次，就是部分技术重复。

04 做代谢组学，采集好的样本可以保存多久？

做代谢组学的样本通常在室温条件下保存时间为0到1个小时，4 ℃保存时间为1到7天；-20 ℃保存时间为1到3个月；-80 ℃保存时间为6到12个月。样本中代谢物时刻都在发生变化，尤其是在高温环境中，因此建议条件允许情况下，采集好样本后尽快安排送样检测。

05 RNA later保存液保存的动物组织还能做代谢组学吗？

RNA later保存液保存的动物组织可以做代谢组学，但-80 ℃保存时间最好不要超过半年，半年以上样本中代谢物可能降解或发生反应。

06 客户寄送到公司的样本，干冰已挥发完，样本是否还能做代谢组学？

干冰已挥发完可能无法用于代谢组学检测，建议重新送样，因为样本存在冻融风险，代谢物可能发生降解，干冰用量建议为5 kg/天。

07 溶血样本是否还能做代谢组学？

溶血样本通常不适合用于代谢组学研究，因为溶血会导致血液中细胞破裂释放细胞内成分，这些成分会对代谢组学分析产生显著的干扰和偏差，从而影响代谢组学研究的准确性和可靠性。研究表明，溶血和清亮血清相比，可引起至少43种代谢物水平明显改变。其中甲酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、鸟氨酸等在溶血样本中升高，而磷脂酰胆碱和鞘脂等脂类的浓度在溶血样本中下降。

08 做代谢组学时，如何判断取样范围是否覆盖整个生物学变化阶段？

当不确定取样范围是否覆盖整个生物学变化阶段，可先做一些生理指标（炎症因子、细胞凋亡等）或PCR预实验，根据生理指标变化，选取取样范围；如果之前做过转录组、蛋白组，可参考转录组、蛋白组取样范围取样；或者查阅相关研究文献，根据文献选择取样范围；对于大样本量项目，可在尽可能宽的范围内选择个别有代表性的样本先做一下预实验，然后根据预实验结果取样。

09 做代谢组学时，血液、尿液样本是否需要在空腹状态下取样？

 做代谢组学时，血液、尿液样本建议在空腹状态下取样。因为食物的摄入可能会影响代谢物的水平，从而导致实验结果的偏差。空腹状态下，血液中的某些成分，如葡萄糖、脂肪和胆固醇等与非空腹差异比较大。空腹状态下尿液中氨基酸与非空腹有较大差异，尿液样本建议取晨起中段尿（临床）或晨间1 h尿（动物）。

10 细菌胞内和胞外代谢产物测定怎么选取样本？

一般上清液用于胞外产物代谢物提取，离心沉淀的菌体用于胞内代谢物提取。

（1）胞内取样步骤

①将1~2 mL菌液转移到离心管（进口）中。

②1000 g离心10 min收集菌体（≥5×106个细胞为宜），弃上清。

③用预冷的PBS小心重悬清洗沉淀一次，4 °C 1000 g离心10 min收集菌体，弃上清。

④再用PBS重悬并离心一次，倒掉PBS，将离心管的尖端插入液氮中，萃灭细胞沉淀1 min。-80 °C冻存，干冰寄送。

（2）胞外取样步骤

①方法一：培养好的菌液混匀后，取10 mL菌液，用0.2 μm孔径的过滤膜进行快速抽滤，去除菌体。将滤液按1 mL/管进行分装，‐80 °C冻存，干冰寄送。

②方法二：培养好的菌液混匀后，取1 mL菌液，3000 rpm，4 °C离心10 min，取上清800 μL，‐80 °C冻存，干冰寄送。

11 血清和血浆哪种样本更适合代谢组学研究？

血清和血浆哪种样本类型更适合代谢组学研究仍然存在争论。血浆的优点是快速处理，不需要等待血液凝结，此外血浆因为没有血液凝集过程而更适宜进行代谢物分析，结果也更容易重复验证，故一般推荐血浆。如有特别关注物质需结合研究目的选择。血清和血浆代谢物差异可参考文献：A review of blood sample handling and pre-processing for metabolomics studies。详细如下：

 12 提取液样本能否做代谢组学？

（1）用甲醇、乙醇、丙酮、丁二醇、正丁醇等常规提取剂提取的样本，可以进行代谢组学检测，但用石油醚、乙醚、苯、甲苯、正己烷、氯仿等提取剂会导致色谱柱堵塞，因此不能检测。

（2）提取试剂或样本中磷酸盐、硫酸盐等非挥发性盐浓度过高，也不能检测。

13 LC-MS非靶向代谢组学的分子量扫描范围多少？

LC-MS非靶向代谢组学的分子量扫描范围是85-1250 m/z。

14 LC-MS非靶向代谢组学能否定量？

非靶向代谢组学结果是相对定量，即样本代谢物在质谱中的峰面积。因为不同物质在质谱中响应、离子化效率不同，同一物质在不同样本中的含量可以比较，但不同物质在相同或不同样本中的含量不能比较。

15 LC-MS非靶向代谢组学、靶向代谢组学检测有什么区别？

与基因组学、转录组学、蛋白质组学相比，代谢组学具有数据量低、易于检测、分析简单、放大效应、终端效应、通用性高等优点。

16  代谢组常用的数据库都有哪些？

代谢物常用的数据库包括KEGG、HMDB、PubChem、MetaCyc、MONA、METLIN、MassBank、mzCloud、GNPS、LipidBlast、Lipidmaps、GMD、SMPDB、BiGG Models、NIST、Fiehn等。

17 如何用KEGG查找研究目的相关的代谢通路？

谷歌浏览器登录https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html网站，然后Enter keywords栏输入关键词，如关注氨基酸可直接输入Amino acids，再点GO就可以查找相关通路，详见往期软文：手把手教你如何使用KEGG数据库

18 代谢组学研究思路是怎么样的？

代谢组学最基本的研究思路是在不同组间直接进行代谢组学检测，对代谢物的含量和种类进行分析，寻找组间差异代谢物，从而找到某个关键代谢物与表型、疾病的关系及其所在的通路，或筛选到疾病biomarker。其次，还可结合靶向代谢组学或其他相应基础验证实验进行验证。此外，还可联合其他组学分析，如转录组学、蛋白质组学、表观组学等，构建基因调控网络，深入理解各个分子之间的调控及因果关系，揭示生理病理机制。

19  中药入血的研究思路是怎么样的？

中药入血的研究思路，首先是通过代谢组学技术确定中药药材、方剂等包含多少种药用成分，然后针对不同疾病构建对应的动物模型，接下来就是通过不同的给药方式或给予同种药物的不同剂量，进行模型治疗，通过疗效观察以确定中药治疗的方案，并进一步对其进入体内的成分即入血成分进行解析，寻找药效物质。通过结合网络药理学分析以及转录组、蛋白组、表观组等多组学技术，挖掘出有效药用成分及关键调控机制。最后从病理指标和生理生化指标来验证中药药效分子机理。详见软文：从经典文献案例看中药入血的研究思路

 20 筛选得到的差异代谢物太少或太多怎么办？

如果用已有的筛选标准得到的差异代谢物过多或过少，可以通过调整参数进行重新分析。如用VIP≥1、P≤0.05且FC≥2或F≤0.5筛选到的差异代谢物很少，可将VIP和P取值范围保持不变，将FC调整至FC≥1.5或FC≤0.67，或者只用VIP、P值进行筛选。

21 为什么关注的物质在进行LC-MS非靶向代谢组学时没有被检测到？

首先目前没有一种检测技术可检测到所有的代谢物。其次，可能检测到了该代谢物的峰，但是当前非靶数据库没有收录该物质，因此无法进行对比定性；再者，可能样本中确实存在该物质，但该物质的浓度较低，低于当前方法的检出限，由于非靶向代谢组学主要是尽可能检出更多的物质，有些浓度较低的物质很可能无法同时兼顾到，因此如果有具体的关注物质，建议进行靶向代谢组学检测。

22 LC-MS非靶向代谢组学检测到目标物种之外的代谢物是否正常？

LC-MS非靶向代谢组学检测到目标物种之外的代谢物是正常现象。一方面LC-MS非靶向代谢组学物质鉴定主要是根据物质的二级碎片、保留时间等与数据库进行匹配打分，定性结果可能存在假阳性。另一方面样本会受到环境的影响，导致样本中存在本物种之外的代谢物，如环境暴露导致生物样本中检出微塑料等非内源性物质，人由于摄入食物（动物、植物等）血液中会检出植物来源的物质。