深度剖析CUT & Tag技术，精准操控基因组的革命性工具

从ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）到CUT & RUN（靶向切割和标记），再到近年来闪耀登场的Cut & Tag（靶向切割和转座酶标记），科研人员操控和解析基因组特定区域的能力正经历着革命性的跃升。其中Cut & Tag以其独特的设计理念和卓越的性能，正迅速成为表观基因组学和基因调控研究领域的明星技术。

一、技术原理

Cut & Tag首先利用固定在刀豆蛋白A（ConA）磁珠上的抗体精准定位到基因组上的目的蛋白，然后将二级抗体作为Tn5转座酶的锚定物，在靶蛋白结合位点附近引导染色质DNA的切割的同时插入NGS测序接头，进而通过测序技术获取目的蛋白结合的DNA序列信息。

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二、操作流程

01 实验前准备

（1）样本准备

细胞样本：＞4 × 106个细胞，需要保持细胞完整性和细胞活性；

组织样本：＞0.5 g组织，特殊组织则＞1 g。

（2）抗体准备

特异性一抗、种属匹配且适合Cut & Tag的二抗；

提前摸索抗体最佳使用量。

（3）Tn 5转座酶

通常选择具有高活性且预装载测序接头的ProteinA/G-Tn 5融合蛋白。

02 操作流程

（1）细胞核提取：使用细胞核提取试剂盒提取细胞核并进行计数（要求活性细胞核＞105个进行后续实验）；

（2）磁珠孵育：将ConA磁珠与细胞核共孵育； 

（3）抗体结合：将结合ConA磁珠的细胞核与一抗共孵育，然后加入二抗进行孵育形成复合体；

（4）Tn 5转座酶结合与激活：将Tn5转座酶加入上一步的复合体溶液中进行混合后立即进行转座酶激活；

（5）DNA回收：使用蛋白酶K消化目的蛋白和抗体，然后使用试剂盒提取基因组DNA；

（6）文库构建：对回收的基因组DNA进行文库扩增和纯化；

（7）测序和分析：对纯化DNA文库进行上机测序并进行相应的数据分析。

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三、技术优势

1、高信噪比，背景噪音极低，对低丰度蛋白友好；

2、高灵敏度，样本量需求低，对稀有样本友好；

3、高分辨率，能更精确定位目的蛋白结合位点；

4、操作简单，湿实验可在一天内完成，节省时间；

5、兼容性高，可用于多种样本类型，并且抗体种类多；

6、通量高，可同时进行多种标记，同一样本可研究多个目标因子；

7、细胞损伤程度低，能更好地保留染色质的原始状态。

四、技术缺陷

1、抗体质量依赖度高，需要高效价抗体，受抗体质量影响大；

2、片段大小与偏好性，Tn 5转座酶切割具有随机性，切割产生的片段大小分布范围较广；

3、无法进行准确定量，Cut&Tag的主要反映目标蛋白的相对富集程度，而非绝对分子数量；

4、无法用于体内研究， 目前Cut&Tag主要在体外培养细胞或处理离体组织上进行。

五、应用案例

01 CUT & Tag解释HK2可能是肝纤维化的有效治疗靶点

美国芝加哥伊利诺伊大学Nissim Hay研究组通过RNA-seq和CUT&Tag染色质谱分析发现，激活的HSC中诱导HK2的表达是通过组蛋白乳酸化而不是组蛋白乙酰化诱导靶基因表达。敲除HK2或通过药物抑制乳酸生成来抑制组蛋白乳酸化会减少HSC的激活，而外源性乳酸补充可以恢复HSCs激活表型。此外，组蛋白乙酰化与组蛋白乳酸化相互竞争，I类HDAC(组蛋白去乙酰化酶)抑制剂会阻碍HSC的激活，HSC特异性或系统性的HK2缺失在体内抑制HSC激活和肝纤维化。

02 CUT & Tag助力解析YY1乳酸化调控自身免疫性葡萄膜炎分子机制

视网膜中活化的小胶质细胞对于自身免疫性葡萄膜炎的发展至关重要。Huang等人发现实验性自身免疫性葡萄膜炎 （EAU） 组内视网膜小胶质细胞中 YY1乳酰化增加，抑制YY1乳酸化能够抑制EAU中的小胶质细胞活化并减轻炎症。借助CUT & Tag技术，研究人员发现YY1乳酸化通过调节炎症基因（STAT3、CCL5、IRF1、IDO1和SEMA4D）的转录来促进小胶质细胞活化。此外，p300被鉴定为 YY1乳酰化的修饰酶。抑制p300可降低YY1乳酰化，并在体内和体外抑制小胶质细胞炎症。综上，作者通过CUT & Tag技术证实YY1 乳酸化通过上调炎性细胞因子分泌和促进细胞迁移和增殖来促进自身免疫性葡萄膜炎中的小胶质细胞功能障碍，靶向乳酸/p300/YY1 乳酸化/炎症基因轴，可以达到治疗自身免疫性葡萄膜炎的效果。

六、Cut&Tag常见问题分析与优化策略

01 CUT & Tag信号弱或无信号

（1）一抗效价或者亲和力低，二抗或Protein A/G-Tn5结合不佳，抗体用量不足或孵育条件不佳；实验前对抗体进行验证并摸索最佳抗体用量。

（2）透化不足，导致抗体或者Tn 5转座酶无法有效进入细胞核；可尝试使用不同去污剂、浓度、孵育时间和温度摸索最佳透化条件。

（3）目标蛋白丰度低或者结合不稳定；可以增加细胞使用量。

（4）Tn 5转座酶活性低；可以使用新鲜试剂并优化转座反应条件。

（5）DNA提取或者文库扩增失败，优化DNA提取和PCR扩增条件。

02 背景噪音高，出现非特异峰

（1）抗体出现非特异性结合，此时需优化抗体用量和孵育时间，适当增加封闭时间。

（2）透化过度、Tn 5使用过量或者洗涤不彻底，导致游离Tn5产生随机切割，此时需优化洗涤次数、透化条件和Tn 5使用量。

（3）细胞死亡和碎片残留，释放的DNA或碎片导致背景产生，此时需严格进行细胞活力质检，处理过程尽量轻柔，避免剧烈涡旋或反复冻融并使用过滤法去除细胞碎片。

（4）外源DNA污染或者PCR过度扩增导致产生背景信号，需要使用无核酸酶试剂和耗材，控制PCR循环数，优化文库扩增条件。

03 文库DNA片段大小异常，过大或过小

（1）转座时间过长或者过短，导致过度切割或者不充分，此时需优化转座条件和时间。

（2）细胞过度透化或者裂解，导致染色质过度暴露或碎片化，需要优化透化条件。

（3）细胞死亡导致样本中含DNA碎片，需要在前期进行严格质检，使用高活力细胞。

（4）DNA纯化或者PCR扩增引入偏差，需要再优化DNA纯化和扩增条件，使用高保真酶，避免PCR偏好性。

04 重复性差，组内差异大

细胞状态不一致（传代次数、密度、处理条件等）、操作不一致、试剂批次、PCR扩增偏差以及测序深度都可能影响重复性。因此在进行CUT & Tag实验时，需确保所有试剂为同批次，保持实验操作尽量一致，不同组间细胞状态类似。

参考文献

Huang JX, et al. YY1 Lactylation Aggravates Autoimmune Uveitis by Enhancing Microglial Functions via Inflammatory Genes [J]. Adv Sci (Weinh), 2024, 11(9):  e2308031.

Rho H, et al. Hexokinase 2-mediated gene expression via histone lactylationis required for hepatic stellate cell activation and liver fibrosis [J]. Cell Metab, 2023, 35(8): 1406–1423.