单细胞转录组分析（实验部分及流程)

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单细胞RNA测序技术发展：

│

├── 起源与发展

│ ├── 2009年：陶复仇教授首次提出

│ └── 初期通量较低

│

├── 技术进步

│ ├── 商业化技术：时程技术、BD技术

│ ├── 微孔技术的应用

│ └── 成本逐渐降低

│

├── 传统RNA测序方法的局限性

│ ├── RT-PCR：只能检测单一细胞或组织

│ └── 基因芯片：只能提供混合数据，缺乏细胞特异性

│

├── 单细胞RNA测序的优势

│ ├── 精准识别单细胞基因表达

│ ├── 解析组织复杂性

│ └── 解决细胞间基因表达异质性

│

└── 在疾病研究中的应用

├── 疾病机制解析

└── 基因表达在特定细胞类型中的作用

单细胞RNA测序的实验部分：

10×法：

1. 样本准备与细胞解离

2. 单细胞分离

3. 建库与测序

单细胞RNA测序的关键步骤之一是建库。在这一过程中，细胞内的RNA会被提取，并进行反转录，将其转化为cDNA。接着，使用特定的试剂和酶对cDNA进行扩增，最后将其转化为可测序的文库。
每个细胞的RNA信息会通过这些"条形码"与特定的细胞关联。最终生成的文库会被送去进行高通量测序，获取基因的表达数据。

4. 数据分析

5. 结果报告与细胞群体分析

数据分析的初步结果通常包括细胞群体的划分和基因表达模式的分析。报告中通常会给出细胞群体的划分结果，但并不总是详细标注每个群体的细胞类型。因此，研究人员需要深入分析这些群体，结合其他实验数据进行细胞的类型识别。
许多商业服务提供商会提供初步的数据分析报告，但这些报告并不总是能满足所有研究需求，特别是在细胞类型的准确识别和基因功能的具体分析上，研究人员往往需要自行优化分析方法。

BD法：

BD Rhapsody 采用的是微孔板（microwell-based）技术

细胞悬液制备：同样需要经过组织解离、细胞活性检测，制备单细胞悬液。

微孔阵列捕获：细胞悬液被随机分配到一个包含约 20 万个微孔的板子上，细胞随机落入这些微孔中。
磁珠标记：随后，每个微孔中加入磁珠（Magnetic Beads），磁珠的大小与微孔匹配，每个微孔中只能容纳一个磁珠。磁珠表面带有条形码（Barcode）和逆转录引物，用于后续的 cDNA 合成。
细胞裂解与逆转录：加入细胞裂解液后，RNA 释放并结合到磁珠表面的引物上，随后进行逆转录，合成 cDNA。
磁性分离：利用磁场回收带有 cDNA 的磁珠，再进行建库和测序。

Smart-seq法：

单细胞捕获：通常利用荧光激活细胞分选技术（FACS） 或 微孔阵列 进行单细胞分离。
RNA提取与逆转录：
- 采用 polyT 引物 结合 mRNA 的 polyA 尾部 进行逆转录（RT），生成 cDNA。
- 过程中会加入特殊接头序列（template-switching），提高反应效率。
全长扩增：
- 采用 Tn5 转座酶（Tagmentation） 进行 cDNA 片段化，并添加测序接头。
- 随后进行 PCR 扩增，构建测序文库。
高通量测序：利用 Illumina 或 PacBio 平台进行测序，获得全长转录本信息。