基因芯片和电脑芯片不是同一类东西，是基因测序平台 geo数据库

基因芯片和电脑芯片虽然都叫“芯片”，但它们在功能、原理和应用上完全不同。为了让你快速把握核心区别，我先用一个表格来概括它们的对比，然后再展开说明。
特征

基因芯片 (Gene Chip)

电脑芯片 (Computer Chip)

核心功能

生物信息检测（如基因序列、表达水平）

信息运算、存储与控制（计算机的核心大脑）

工作原理

生物分子杂交（碱基互补配对原理）

晶体管开关电路（处理电信号，通过0和1进行二进制运算）

主要材料

玻璃片、硅片、尼龙膜等基底，其上固定核酸、蛋白质等生物探针

高纯度硅半导体，集成晶体管、电阻、电容等电子元件

制造工艺

微点样、光导原位合成等生物技术

光刻、蚀刻等微电子加工技术

输出结果

荧光信号、数据图像（反映生物分子种类和数量）

电信号、数据处理结果

应用领域

疾病诊断、新药研发、司法鉴定、食品安全检测、基因功能研究等生命科学领域

计算机、智能手机、家电、汽车、工业设备等几乎所有电子设备

深入了解基因芯片

基因芯片，又称DNA芯片或生物芯片，其本质是一种高通量的生物检测工具。它的工作原理是基于核酸分子杂交（即碱基互补配对原则）。简单来说，就是先把大量已知序列的DNA片段（探针）像撒种子一样有序地固定在很小的基片（如玻璃片）上。当带有标记的待测样本（如从病人身上提取的DNA）滴到芯片上时，样本中的DNA会寻找并结合与之互补的探针。通过检测结合点的信号强度，就能分析出样本中含有哪些基因、这些基因是否发生突变或者表达水平如何。

它的主要特点是高通量、微型化和自动化，能一次对数以万计的生物分子进行快速分析。正因如此，它被广泛应用于基因表达分析、疾病诊断（如遗传病、癌症分型）、药物筛选、病原体检测等领域。

深入了解电脑芯片

电脑芯片，通常指的是集成电路，是电子设备的信息处理核心，常被比作计算机的“大脑”或“心脏”。它的核心功能是执行指令、进行运算和存储数据。

电脑芯片的工作依赖于大量微型晶体管的开（1）和关（0），通过这无数的0和1来完成各种复杂的计算和逻辑操作。制造电脑芯片的过程极其复杂，涉及光刻、蚀刻、离子注入等尖端微电子工艺，旨在硅片上集成尽可能多的晶体管，以提高其性能。

从计算机的CPU（中央处理器）、GPU（图形处理器），到手机里的SoC（系统级芯片），再到各种存储器，电脑芯片是现代所有智能电子设备的基石，驱动着我们的数字世界。

简单总结

你可以这样理解它们的本质区别：

基因芯片是一个实验室平台，用于获取和分析生物信息。它本身不进行计算，而是帮助我们“读取”生命的密码。
电脑芯片是一个信息处理引擎，用于运算、存储和控制电信号。它负责“思考”和“执行”任务。
希望以上解释能帮助你清晰理解它们的区别。如果你对某一特定应用场景更感兴趣，我可以提供更具体的信息。

基因芯片（Microarray），也叫DNA芯片或生物芯片，是生命科学研究中一项重要的高通量检测技术。它能够一次性并行分析成千上万个基因的信息，在很多领域都有应用。
基因芯片工作原理
基因芯片的核心原理是核酸分子杂交。你可以把它想象成一个非常微型的、排列着无数“探针”的实验室平台：

制备芯片：通过原位合成（如光刻技术）或合成后微点样的方法，将大量已知序列的DNA片段（探针）高密度、有序地固定在一块小小的玻璃片或硅片等固相支持物上 。
样本处理与标记：从待测样本（如细胞或组织）中提取RNA并反转录成cDNA，或用其他方式获取靶分子，并用荧光物质等进行标记 。
杂交反应：将标记好的样本与芯片上的探针进行杂交。只有序列完全互补或高度相似的分子才会牢固结合 。
信号检测：用激光共聚焦扫描仪等设备扫描芯片。探针与样本结合的位置会产生荧光信号，信号强弱反映了靶分子的数量 。
数据分析：通过计算机软件对荧光信号进行采集和分析，最终获取样本的遗传信息 。
*基因芯片工作原理（基于杂交测序方法）示意图，图示仅为原理简化呈现 *

基因芯片的主要类型
根据探针类型、制造工艺和用途，基因芯片主要有这些类型：

类型

说明

特点

cDNA芯片

将预合成的cDNA片段点样到芯片上

探针较长，特异性较高，但密度相对较低，多用于基因表达谱分析

寡核苷酸芯片

主要通过原位合成（如光刻技术）制作，探针为较短的特异寡核苷酸序列

探针密度非常高，可集成大量探针，通量大

SNP芯片

用于检测基因组中的单核苷酸多态性（SNP）

广泛应用于群体遗传学、疾病关联分析、药物基因组学等领域

染色体芯片 (aCGH)

用于检测染色体拷贝数变异（CNV），如微缺失、微重复等

在产前诊断、发育迟缓、智力障碍等遗传性疾病诊断中发挥重要作用

miRNA芯片

专门用于检测微RNA（miRNA）的表达水平

用于研究miRNA的调控机制及其在疾病发生发展中的作用

基因芯片的主要应用
基因芯片技术因其高通量、并行化、自动化的特点 ，在多个领域广泛应用：

基因表达谱分析：这是基因芯片最经典的应用之一。可以同时检测成千上万个基因在特定状态（如疾病、发育阶段、药物处理）下的表达水平变化，帮助发现关键基因 。
疾病诊断与分型：例如用于肿瘤的分子分型、遗传性疾病的筛查（如染色体异常检测）和病原微生物的鉴定 。基因芯片能快速检测大量基因变异或病原体特异性序列，提供诊断依据。
药物研发与筛选： 毒理学研究：快速筛选环境中通过特定基因对生物体产生毒害作用的因素 。 药物基因组学：研究遗传变异如何影响个体对药物的反应，助力个性化医疗 。
基础科学研究：在辐射生物学中，基因芯片用于分析辐射剂量效应、研究肿瘤辐射抗性机制以及筛查放射性损伤的分子标记物 。在疟原虫研究中，基因芯片被用来分析不同发育阶段基因表达的差异，探索致病机制 。
其他领域：在农业上可用于筛选优质、高产、抗病性强的作物品种 ；在商品检验检疫中能快速检测病原体或转基因成分 。
⚖️ 基因芯片的优势与局限
虽然基因芯片功能强大，但它也有自身的优缺点：

优势：
高通量并行分析：一次实验可同时检测数万至数十万个靶点，效率远超传统方法 。
自动化程度高：从杂交到信号检测，自动化减少了人为误差 。
所需样品量少：微升级别的样品即可完成检测 。
应用范围广：如前所述，其应用覆盖了科研、医疗、农业等多个领域。
局限：
依赖已知序列：芯片探针基于已知序列设计，难以发现全新的、未知的基因或序列变异 。
灵敏度与特异性限制：存在交叉杂交的可能性，背景信号有时较高，对低丰度目标分子的检测可能不够灵敏 。
通量虽高但灵活性相对不足：一旦芯片设计制作完成，其检测目标就固定了，不如测序灵活。
正在被替代：随着下一代测序（NGS）技术的迅猛发展和成本下降，许多曾经由芯片主导的应用领域（如无创产前检测、群体基因组学测序）正逐渐被NGS替代 。NGS不仅能进行数字化定量，还能发现未知变异。当然，芯片在特定靶向性应用（如基因分型、CNV检测）和成本控制方面仍有其价值和市场 。
总结
基因芯片作为一项重要的高通量基因组学研究工具，其高通量、自动化的特点使其曾在功能基因组学、临床诊断和药物研发等领域发挥了革命性的作用 。虽然近年来下一代测序技术（NGS）的发展使得基因芯片在一些领域的应用受到了挑战 ，但它在针对已知变异的快速、低成本、大规模筛查方面仍然具有实用价值。

希望以上信息能帮助你更好地了解基因芯片。如果你有特定的应用场景想了解，我可以提供更具体的信息。

昂飞（Affymetrix）和 Illumina（常被音译为“一路米”）都是生命科学领域中的重要基因分析技术平台提供商，它们各自有不同的技术侧重点。我会为你介绍它们的主要技术平台和特点。
Affymetrix（昂飞）基因芯片平台
Affymetrix 是美国的一家生物芯片公司，是基因芯片产业的先行者。

核心技术：Affymetrix 开发的 寡核苷酸原位光刻合成技术（light-controlled in situ synthesis of DNA microarrays），是目前最高密度的芯片制备技术之一，可以在每平方厘米的基片上合成超过400万个探针。
独特的探针设计：其基因表达谱芯片采用 PM-MM 探针设计（完全匹配和错配探针）。针对每段参考序列设计一对25-mer探针，一个是完全匹配（PM）探针，另一个是中间位点错配（MM）探针。这种设计有助于区分特异性和非特异性结合，提高检测的灵敏度和特异性，尤其在复杂背景样品中检测低丰度表达产物时具有优势。
GeneChip 系统：这是一个完整的检测平台，包含高密度基因芯片、杂交扫描仪器以及数据处理分析工具。该系统高度自动化，能减少手工操作时间，提高数据重复性，可用于RNA和DNA的多方面应用研究。
GeneTitan 系统：这是全自动高度集成的芯片工作站，实现了从杂交到扫描全过程自动化，非常适合多样本高通量检测，例如大规模样品的GWAS研究。
主要应用领域：Affymetrix 芯片产品非常丰富，广泛应用于基因表达研究（如发现新信号通路、疾病分型、药物作用机制验证等）和DNA研究（如SNP分型、全基因组关联分析（GWAS）、拷贝数变异（CNV）分析、杂合性丢失（LOH）检测等）。
Illumina（一路米）基因测序平台
Illumina 是全球领先的基因测序仪供应商，尤其以高通量测序技术闻名。

市场地位与技术：Illumina 是全球基因测序仪器市场的领导者，长期占据主要市场份额。其技术核心是二代测序（NGS，又称高通量测序）。这种技术一次可对几十万至几百万条DNA分子同时进行快速测序分析，显著降低了测序成本和时间，并保持了高准确性。
技术特点与局限：Illumina 的 NGS 技术通量大，价格相较于早期测序技术大幅降低。但其读长相对较短，流程较为复杂，无法覆盖更广泛临床场景下复杂样本的所有测序需求。
针对临床的解决方案：Illumina 也提供诸如 Oncomine™ Comprehensive Assay 这样的靶向测序解决方案。该方案基于 Ion Torrent™ 新一代测序平台和 Ion AmpliSeq™ 技术，能够从少量FFPE样本核酸（仅需10ng）中检测143个基因的相关变异（SNP、CNV、基因融合和Indel），并具有较快的周转时间。
自动化集成系统：Illumina 的 Genexus 系统 提供了高度自动化的NGS工作流程，号称能在一天内完成从样本到报告的全过程，降低了NGS技术的操作门槛，即使是不熟悉该技术的实验室也能开展相关研究。
昂飞（Affymetrix） vs. Illumina（一路米）主要特点对比
为了让你更直观地了解两者的区别，下表汇总了它们的主要特点：

特性方面

Affymetrix（昂飞）

Illumina（一路米）

核心技术

基因芯片（Microarray）

高通量测序（NGS）

技术原理

杂交

边合成边序列

主要应用

基因表达谱、SNP分型、CNV分析、GWAS

全基因组测序、外显子组测序、转录组测序、靶向测序

读长特点

依赖于预设计的探针

短读长（主流技术）

通量

高（一张芯片可同时检测大量目标）

非常高（一次运行产生海量数据）

主要优势

技术成熟、数据稳定、分析流程简洁、成本相对较低（针对特定应用）

通量高、可发现未知变异、应用范围极其广泛

主要局限

只能检测已知序列、无法发现新变异

短读长在解决复杂基因组区域时存在挑战、数据处理分析更复杂

典型系统

GeneChip 系统, GeneTitan 系统

MiSeq, NextSeq, NovaSeq, Genexus 系统

样本需求

相对较低（如表达谱芯片最低仅需10-100ng RNA）

因应用而异（靶向panel如Oncomine可低至10ng）

如何选择平台
选择昂飞（Affymetrix）还是 Illumina，主要取决于你的研究目标和预算：

明确研究需求：若研究目标是检测已知的基因变异或表达差异（如验证特定基因集的表达、进行大规模的基因分型或拷贝数变异分析），昂飞的基因芯片可能更经济高效。若需探索未知变异、进行全基因组测序或需要极高通量，Illumina的NGS平台更合适。
考虑样本数量与预算：芯片通常单次实验成本较低，适合大样本量的筛选。NGS则能提供更多信息，但设备和数据处理成本可能更高。
关注技术发展趋势：NGS技术发展迅速，应用越来越广。但芯片技术在特定领域因其稳定性和成本优势，仍有其价值。
总结
总的来说，昂飞（Affymetrix） 和 Illumina 是基因分析领域两种重要技术路线的代表。

昂飞（Affymetrix）的基因芯片擅长对已知目标进行高通量、高性价比的检测，技术成熟稳定。
Illumina 的高通量测序（NGS） 则提供了探索未知和进行全面基因组分析的强大能力，应用范围更广。
选择时，关键是看你的具体研究内容和资源。希望这些信息能帮助你更好地理解它们。

背景知识 GEO数据库 芯片数据及针对各种物种的测序数据
部分生物信息学相关数据都会由全世界各地的科研工作者上传到GEO数据库，包括各种芯片数据及针对各种物种的测序数据，它们的样本数排序如下：

平台流行程度

由上表可以看出，到目前为止（2017年）累积应用最广泛仍然是mRNA的表达谱检测芯片，以affymetrix的 Human Genome U133 Plus 2.0 Array和illumina的HumanHT-12 V4.0 expression beadchip为代表。 高通量测序作为后起之秀已经逐渐在超过芯片数据样本量了，而且高通量测序几乎都是illumina的测序仪产出的，包括HiSeq 2000/2500，nextSeq500,MiSeq等等。虽然HiSeq X10并没有排在前面，原因其实是GEO公布的数据与现实有两到三年的时差，因为测序数据需要发表文章之后才会公布，而且可以设置一到两年的释放期限。

值得一提的是HiSeq X10作为目前通量最高的测序仪，其大多测的是人类癌症病人相关数据，而这些数据因为隐私问题，很多都是不予公开的，需要注册申请才能下载。

下面我们就GEO里面存放的数据进行分门别类的介绍，分首先是芯片数据，包括各种生物学应用的芯片，然后是高通量测序数据，包括二代三代测序数据。

1.1芯片技术
早期的生物信息学数据都是由芯片产生，2001年做两百多个mRNA表达谱芯片数据分析都可以发nature，虽然现在逐渐被NGS替代了，但是成本方面却还是它们的优点，所以仍然会有不少科研项目选择芯片来检测样本。

这样，做生物信息学数据分析的我们还是得掌握它们的基本分类，历史，以及处理方法。而且已经发表的芯片数据量非常庞大，在里面进行一些探索性挖掘也会有意想不到的收获。当然，前提是要下功夫了解芯片，学习它们。

1.1.1三大芯片制造商
在GEO数据库里面查看GPL信息，就可以看到芯片厂商出品的数据排名，基本上就是 affymetrix , illumina , agilent 这3家公司为主。

Affymetrix
昂飞（Affymetrix）公司，基因芯片行业的先驱，全球销量第一的基因芯片厂家。它是第一款商业化基因芯片的诞生之地，它是全球基因芯片行业标准的制定者。

上个世纪八十年代，Stephen P.A. Fodor博士与他的科学家团队将组合化学技术与半导体制造技术结合，尝试在小玻璃芯片上建立大量生物数据。这一革命性的想法经过他们十多年的钻研尝试，成为了现实——他们发明出革命性的基因芯片GeneChip®技术。这一技术迅速进行商业转化，由Affymax公司的Affymetrix部门专职运营。

1992年，Stephen P.A. Fodor博士带领Affymetrix部门从Affymax公司独立出来，在硅谷中心单独成立公司，名字仍采用Affymetrix，也就是现在的Affymetrix公司。公司最初的发展受到美国政府先进技术计划项目的经费支持，而公司也没辜负联邦政府的期望，1994年就开始将GeneChip®专利技术进行商业化运营，并于1996年在纳斯达克上市。Affymetrix以基因芯片为立家之本，陆续收购包括分子生物学试剂USB、免疫学试剂公司eBioscience等多家生物医学公司，形成了环绕基因组学和蛋白组学的庞大产品生态群。

Affymetrix公司致力于研发能够在细胞、蛋白和基因水平对生物系统进行多重和平行分析的技术，促进科研人员研究成果的转化，使科学家和临床医生能够将其研究成果更快地转化为对疾病的治疗技术，并在农业领域促进基因标记辅助育种技术的发展。

Affymetrix公司的客户遍布于生物学科研工作的各个领域，包括生物制药、临床诊断、农业育种、食品安全和消费品行业，同时还包括科研院所、政府实验室和其他非盈利性研究机构等。

Affymetrix公司曾入围全球50个最具创新能力公司和2011年度Frost & Sullivan北美产品领袖奖。公司于1996年在美国纳斯达克(NASDAQ)上市，总市值超过30亿美元，20年来，凭借在美国股票市场上的融资，Affymetrix公司在企业并购的路上一路狂奔。

2000年2月，Affymetrix 收购了DNA芯片仪器公司Genetic MicroSystems；
2000年10月，Affymetrix收购了计算基因组学公司Neomorphic；
2005年，Affymetrix收购了基因研究公司 ParAllele BioScience，随后又收购了分子生物学和生物化学试剂产品公司USB及膜蛋白提取纯化产品公司Anatrace；
2008年，Affymetrix收购了基因标记公司True Materials 和芯片公司Panomics；
2012年，收购了免疫肿瘤研究和诊断公司eBioscience。
然而，Affymetrix公司也逃不过被并购的命运。在2016年1月9日，全球最大的科学仪器生产商赛默飞世尔科技公司表示，同意13亿美元现金收购美国芯片制造商Affymetrix，以加强其基因分析产品相关业务。

在GEO数据库里面，Affymetrix芯片的样本排序是：

Affymetrix芯片排序

Illumina
Illumina总部位于美国加州圣地哥。它们的二代测序技术太出名以至于掩盖掉了其芯片产品的关辉，在GEO数据库可以查到它们的芯片科研市场占有率也不可小觑。 Illumina的核心技术是光纤微珠芯片平台和Solexa测序平台，广泛应用于基因组学研究。 其新一代激光共聚焦光纤微珠芯片技术，具有高密度，高灵敏度，高重复性，定制灵活等特点。 该平台主要应用于功能基因组学基因表达的研究和SNP基因分型研究，可高精度地对数千甚至数万个SNP位点及基因表达谱、LOH、染色体片段重复等进行检测和分析。

芯片优点有：

•杂交效率高-每个微珠连有约80万条同种探针，加之微珠的空间效应，杂交效率高。
•数据质量高-每个珠子在芯片上随机分布，且高达15~30倍重复，数据质量高。
•完全的质控-独特的解码技术，使得每个珠子每种探针都能得到质控。
•良好的重复性-芯片具有良好的重复性，相关系数R2大于0.99。
•高灵敏度低上样量-低至ng级的核酸样本就即可有效检测。
•定制灵活-可根据不同使用者研究需求量身打造芯片产品。
•广泛的应用范围-光纤微珠芯片广泛应用于SNP基因分型研究、基因表达的研究和甲基化研究。
在GEO数据库里面，Illumina芯片的样本排序是：

Illumina芯片排序

不得不提的是Illumina公司的产品线除了上面提讲解的通量生物芯片，更为流行的其实是高通量测序仪，当然，还有少量定量PCR仪。

高通量生物芯片技术是Illumina公司成长的第一个里程碑，在人类基因组计划完成后，生命科学研究进入后基因组时代，对于SNP的研究成了基因功能研究的主要技术手段，国际上也有了专门针对SNP研究的Hapmap计划，而Illumina公司的高通量芯片称为Hapmap计划的主要技术平台，所有Hapmap的数据，80％以上都来自于Illumina的高通量芯片平台，全世界科学家选择Illumina芯片平台的主要原因也在于此。

高通量测序仪可谓是Illumina最大的产品线，高通量测序技术的出现和发展可以说是近五年时间内生命科学领域最具有革命性发展的技术之一，它极大的加速了整个科学研究的进程，也改变了应用领域和临床研究及诊断的思路。目前，公司主打产品有MiSeq测序仪、HiSeq X Ten测序仪、Miseq FGx测序仪、NextSeq 500/550桌上型测序仪、MiniSeq台式测序仪等等。

定量PCR仪Eco，是Illumina公司在2010年收购另外一个定量PCR仪厂家而扩增的产品线。定量PCR仪是目前分子生物学实验中常用的核苷酸检测设备，已经被广泛应用于生命科学领域的各个方面，包括新药开发研究、药物疗效研究、药物预后指标研究等等。

agilent
Agilent的生物芯片（系统）和别的公司的生物芯片（系统）一样，同样由：扫描仪、生物芯片、分析软件，三部分组成。

Agilent的芯片扫描仪，叫SureScan DX。SureScan DX已经取得了欧洲的CE认证，和中国的CFDA认证，可以应用于临床。

Agilent的CGH生物芯片，在细胞遗传学中有着很广泛的接受度，并可以临床应用。 Agilent的表达谱芯片，是用荧光素直接标记的，检测灵敏度高、检测速度快、检测的线性范围大，很受欢迎。另外比较受欢迎的就是Agilent的miRNA相关芯片了。

在GEO数据库里面，Agilent芯片的样本排序是：

Agilent芯片排序

1.1.2表达谱芯片
最初的芯片就是为了检测mRNA的表达量而设计开发的，而affymetrix就是其中的佼佼者。

表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核苷酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片. 待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA，并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去， 再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。 用于研究基因表达的芯片可以有两种：① cDNA芯片；② 寡核苷酸芯片。

早期的表达谱芯片主要是Affymetrix公司的hgu系列，包括95,133 出货量最大的应该是hgu133plus2系列了，如下

统称为旧版的affymetrix芯片，用R语言的affy包即可读取进行数据处理，我曾经写过教程：用affy包读取affymetix的基因表达芯片数据-CEL格式数据 就是下面的代码：

把所有的cel文件都放在一个文件夹(比如/home/jmzeng/your/celfiles文件夹)下面，文件夹地址赋给变量 dir_cels

dir_cels=‘/home/jmzeng/your/celfiles’
library(affy)
#perform mas5 normalization
affy_data = ReadAffy(celfile.path=dir_cels)
eset.mas5 = mas5(affy_data)
exprSet.nologs = exprs(eset.mas5)
exprSet = log(exprSet.nologs, 2) #transform to Log_2 if needed

上面是是mas5)，下面是rma，两种不同的芯片数据处理方法，最后都是要生成表达矩阵。

library(affy)
data <- ReadAffy(celfile.path=dir_cels)
eset <- rma(data)
write.exprs(eset,file=“data.txt”)
还有新版的表达谱芯片，比如Human Gene 1.0 St Array

用R语言的oligo包来进行数据处理，我曾经写过教程：用oligo包来读取affymetix的基因表达芯片数据-CEL格式数据，把芯片数据转换为表达矩阵的核心代码如下：

library(oligo)
celFiles <- list.celfiles()
affyRaw <- read.celfiles(celFiles)
library(pd.mogene.2.0.st)

根据芯片平台来载入芯片设计包，没办法自动选择

不同的芯片探针包不一样：mogene20sttranscriptcluster.db

eset <- rma(affyRaw)
write.exprs(eset,file=“data.txt”)
affymetrix还开发了更新版的表达谱检测芯片，比如针对人类的HST2.0，据文献报道其很多方面都优于转录组测序，这款芯片设计比较复杂，如下：

不过，illumina的表达谱芯片也是非常出名的，比如Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip。

需要用R包lumi来处理illumina的bead系列表达芯片，见我博客教程

上述表达谱芯片在GEO里面的代表性数据有：

GEO地址

数据描述

GSE11072

2009-gastric cancer SBC Human 16K cDNA Microarray

GSE42872

2015-melanoma-vemurafenib HuGene-1_0-st

GSE2467

2015-hub-gene-mcode-retinoblastoma HuGene-1_0-st

GSE22863

2011-NSCLC HuGene-1_0-st

GSE622221, GSE4180414, GSE5140122

A total of 117 samples (54 cases and 63 controls) Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 2015-HCC

GSE21815

2016-CRC Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K

公布这些数据的文章里面都有对这些数据处理的方法的详细描述，以及对应的分析结果。

1.1.3基因分型芯片
在人类基因组中，基因变异以许多不同的形式存在，包括体细胞突变、单核苷酸多态性（SNP）、拷贝数变异（CNV）和结构改变（插入缺失，Indel）。研究这些变异需要强大的基因分型工具。 其中最出名就是Affymetrix的SNP6.0芯片以及illumina的OMIN系列，下面是详细介绍：

一、基于GeneChip平台的基因分型芯片

芯片推荐： Genome-Wide Human SNP Array 6.0
芯片介绍： Affymetrix Genome-Wide Human SNP 6.0芯片产品涵盖超过1,800,000个遗传变异标志物：包括超过906,600个SNP和超过946,000个用于检测拷贝数变化（CNV, Copy Number Variation）的探针。
芯片推荐：DMET™ Plus
芯片介绍：人类基因组上的差异（SNP、插入、缺失、复制等）会导致不同个体对同一药物产生不同的反应。针对这种情况，Affymetrix推出了DMET（Drug-MetabolizingEnzymes and Transporters）Plus完整解决方案。它能检测225个基因中与药物代谢和转运有关的1936个分子标记。这些分子标记已经在不同种族、至少1200个个体中验证。通过检验不同个体分子标记的差异，研究者们可以发现药物发挥不同作用的遗传机制，从而决定药物的剂量和使用对象。
二、基于GeneTitan平台的Axiom®基因分型芯片

Axiom®基因分型解决方案为您提供多种芯片。您可以选择要研究物种的自定义内容，也可以选择来自Axiom®基因组数据库的基因型经过验证的内容。

芯片推荐：Infinium OmniZhongHua-8 Kit

覆盖了中国人特有常见和稀有变异，是第一款人类种群特异的全基因组芯片。经过优化的标签SNP内容来自HapMap所有三个阶段以及千人基因组计划（1kGP），可用于在中国人种群中探索全新的疾病和性状关联。特别覆盖中国人81%的常见变异（MAF>5%）和60%的稀有变异（MAF> 2.5%），适合全基因组关联研究（GWAS）。采用Illumina专利的BeadArrayTM技术，可提供非常高的数据质量，平均检出率>99%，重复率>99.9%。

illumina的Omni系列芯片经过了许多年的市场迭代，能检测的位点也越来越多，下面是它的一个简单的汇总表格。

illumina的Omni系列芯片进化史

参考：
https://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_gwas_roadmap.pdf

1.1.4CNV芯片
拷贝数变异（CNV）是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1 kb 以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的缺失和重复。 CNV 是基因组结构变异 ( SV ) 的重要组成部分。CNV 位点的突变率远高于SNP，是人类疾病的重要致病因素之一。 大量研究表明，尤其是肿瘤，与拷贝数变异密切先关。

能检测CNV的手段主要有：全基因组测序、生物芯片、CNVseq、CNVplex、AccuCopy、质谱法、Taqman法。

Affymetrix SNP6.0 array
其中最出名的要属Affymetrix SNP6.0 array这款芯片 ，在TCGA计划和CCLE里面都有。芯片特有超过180万个遗传变异标记，包括单核苷酸多态性（SNP）以及拷贝数变异（CNV）。对CCLE数据库可以做的分析非常多，强烈建议初学者花时间好好了解一下，我博客也写过教程

值得一提的是拷贝数变异的检测目前是以芯片技术为标准，NGS技术仍然是落后于芯片技术，在这一点上面。对于Affymetrix SNP6.0 array这款芯片得到也是CEL文件的原始数据，可以走PICNIC软件的流程来进行分析，得到最后的拷贝数变异的片段。

affymetrix公司的OncoScan平台
使用Affymetrix OncoScan FFPE芯片对肿瘤相关样品(包括cfDNA与FFPE样本)进行试验与数据分析，并通过OncoScan 3.01软件找到与临床相关的拷贝数变异（CNV）和杂合性缺失（LOH）。

突破性的技术：在短短48小时内完成全基因组范围的实体瘤拷贝数分析，仅需80ng起始DNA。 全新的OncoScan FFPE芯片利用Affymetrix独特的分子倒置探针（MIP）技术，能够快速经济地分析来自FFPE样本的少量的高度降解的DNA，让实体瘤癌症分析向前迈进了一大步。 这一新产品在一次实验中即可提供全基因组范围的拷贝数数据，且在全基因组内大约900个已知的癌基因、杂合性缺失（LOH）上的分辨率极高，同时可以提供临床相关的获得性突变的数据。在分析软件方面，研发人员升级了早一代的BioDiscovery Nexus软件，增加了许多转为癌症分析设计的功能，命名为OncoScan™ Nexus Express软件，它实现了几分钟内数百个样本的拷贝数分析能力，也将随产品免费提供。 此项技术之前是通过Affymetrix研究服务实验室的OncoScan™ Express 2.0服务来提供的，展现出空前的成功率，在过去两年已有70多篇文章发表。该平台实现了高度降解样本的DNA检测，从保存了十年或以上的FFPE样本中挖掘出丰富的信息。

目前Affymetrix的OncoScan在GEO平台的地址是：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL18602

Status

Public on Apr 23, 2014

Title

[OncoScan] Affymetrix OncoScan FFPE Assay

Technology type

in situ oligonucleotide

Distribution

commercial

Organism

Homo sapiens

Manufacturer

Affymetrix

截止到目前(2017年09月07日)仅有22个实验数据，共355个样本的公共数据被上传。是非常新的平台

1.1.5甲基化芯片
DNA甲基化对基因表达调控起着重要作用，而且这种调控作用可以随着细胞分裂在世代间稳定遗传。 甲基化多发生于胞嘧啶位置，在细胞和组织分化、发育、衰老、疾病发生以及适应环境等过程中，甲基化状态可能随时发生变化。 非正常的DNA甲基化及其导致的基因表达往往与疾病相关联，例如肿瘤、精神性疾病、X-染色体沉默、自身免疫疾病等。

DNA甲基化已成为当前分子生物学的研究热点之一。而芯片是探索DNA甲基化程度的一大利器，在通量，覆盖度，性价比方面都优于二代测序技术。 且主要由illumina公司生产，产品进化路线是 27k –> 450K –> 850K。 在TCGA计划的早期使用过不少27K的芯片，但是其覆盖位点太少，中后期全面转向为450K，同时也是GEO数据库里面被发表最多的甲基化芯片数据。

下面着重介绍一下最新款的IlluminaInfinium Methylation EPICBeadChip（850K）

该款芯片全面覆盖表观基因组的关联研究，可以基于单核苷酸分辨率定量检测基因组中的甲基化位点，主要优势如下

高通量的定量检测：可同时检测>850,000个位点；
全面的全基因组覆盖范围：覆盖>95%的CpG岛，99%的RefSeq基因，保留了>90%的450K甲基化位点；
覆盖了增强子区域：在增强子区域新增了350,000个甲基化位点（包括ENCODEenhancers，ENCODEopenchromatin，>80% ofFANTOM5 Enhancers，GENCODEgenes，promoters，UTRs）；
分辨率高：单碱基分辨率，可以直接检测到发生甲基化的准确位点；
可重复性高：技术重复的重现性>98%，与450K芯片的重复性>98%；
DNA起始量低：仅需250ng，相比于450K芯片的1ug DNA，大大节约了样品量；
高质量的实验数据：使用Infinium技术，无其它甲基化DNA捕获方法常有的偏向性，同时采用Infinium I和Infinium II探针设计，进一步保证高质量的实验数据；
兼容FFPE样本，支持LIMS及自动化系统。
一个基因会设计多个探针，尤其是结构复杂的基因，一般会在启动子区域，utr区域，外显子，内含子等genebody上面设计探针，如果想把探针ID对应到具体的基因的具体区域，需要去其芯片官网找manifest文件。

1.1.6miRNA芯片
microRNA(microRNA)是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。通过与靶基因的3’UTR配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译，从而抑制靶基因的表达。

现在，miRBase共收录223个物种的28645个microRNA前体，35828个成熟microRNA (miRBase, v21, 2014年6月)。这些数据可以在它的官网直接下载.

为miRNA研究设计芯片的主要是Agilent公司，比较成熟的产品是Agilent microRNA芯片（V21.0）产品信息

pecies

Name

P/N

Design ID

Format

Human

SurePrint G3 Human miRNA Microarray, Release 21

G4872A

070156

8 x 60K

Mouse

SurePrint G3 Mouse miRNA Microarray, Release 21

G4872A

070155

8 x 60K

Rat

SurePrint Rat miRNA Microarray, Release 21

G4471A

070154

8 x 15K

1.2二代测序技术
又称下一代测序，就是NGS啦

2005年454公司的 Genome Sequencer 20 System，2006年illumina公司的Solexa和2007年ABI公司的SOLiD标志着第二代测序技术的诞生。 之后陆续在2006年推出454 FLX系统、2010年推出illumina HiSeq系统和同年推出的基于半导体芯片测序技术的Ion PGM已经陆续成为当前基因测序的中坚力量。

1.2.1NGS先行者：454及其序列数据
说到二代测序，454公司可谓是不折不扣的吃螃蟹的人。早在2005年，454就推出了第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这也是NGS领域的第一台测序仪。随后，454被罗氏收购，并在2006年推出了名动测序界的GS FLX测序系统。

454的技术核心在于乳液PCR和焦磷酸测序法，该技术能获得较长的序列，平均读长可达400 bp；相对于illumina平台其主要缺点是无法准确测定单碱基重复序列的长度。

454 GS-FLX测序仪产生的序列文件格式为SFF (Standard Flowgram Format)，是一种二进制文件。虽然目前有很多软件可以直接读取SFF格式文件进行分析，但更多的软件还是需要把SFF格式转换为Fna-Qual格式，这种格式把序列和与序列对应的碱基质量分别放在以Fna和Qual为后缀的文件里(文本文件)。

①.fna数据文件保存碱基序列

HKSD5CR01D6P3Ilength=70 xy=1599_2828 region=1 run=R_2012_03_15_01_23_26_GGAGTAGCATGCGTGACGAATCGTAGTTCCGACCATAACGATGCCGACCTTTGACCA
②qual数据文件保存碱基质量值

HKSD5CR01D6P3Ilength=70 xy=1599_2828 region=1 run=R_2012_03_15_01_23_26_40 40 40 40 40 40 4040 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 39 39 39 40 40 40 34 34 34 34 40 30 3030 40 39 39 39 38 38 37 40 40 38 38 32 24 17 17 20 20 26 30 30 36 36 37
随着测序成本的不断降低，尽管读长偏长，但成本过于昂贵的454测序技术逐渐退出了科研界。 然而，虽然454的生命科学测序业务早已关停，454带来的影响却仍不容磨灭。 来自众多大型科研项目（例如人类微生物组计划）中的海量454序列信息，仍是当今研究中不可或缺的重要参考数据和引用来源。

1.2.2渐行渐远：SOLiD及其序列数据
再来谈谈几乎快被遗忘的ABI公司。事实上，在454和illumina走入市场之前，ABI一直处理测序市场上傲视群雄的霸主地位。 在454和illumina初亮相后，由于SOLiD系统采用的是连接法而非PCR反应，因此对于高GC含量的样本具有非常大的优势。 然而，后续SOLiD系统通量难以提升，且读长短、成本高，也已慢慢退出历史舞台。

SOLiD技术，其主要核心是油包水PCR和基于“双碱基编码原理”连接测序法。 该技术主要优势在于每个位置的碱基均被检测两次，测序准确性高达99.9999%，算是第二代测序技术中准确性最高的。 但是该技术的读长仅为2X50 bp，后续序列拼接等比较复杂，且由于是双碱基对应一个荧光信号，一旦发生错误，容易在荧光解码阶段产生连锁错误。

SOLiD技术的原始数据格式是csfasta及与其匹配的qual，可以利用python脚本或者perl脚本 将其转为csfastq(color space fastq)，与fastq格式一致，四行记录一碱基序列，区别在于第二行不是碱基序列，而是color的编码，如下：

@SRR2967009.1 100_1000_1168_F3
T10011023211201220121202030102221012302121010131001
+
2@@@@>@?@@@@<@@//;@@/@9?@8@=@@@6;6@66;<@6@67?2?;/@
colorspace编码规则为：

虽然csfastq与目前流行的fastq格式记录的测序序列不同，但是csfastq文件也可作为fastqc的输入文件进行质控,并可利用多款软件进行后续分析，如SHRiMP、Sequel、BFAST和Bowtie等等。

1.2.3一家独大：illumina及其数据
illumina在NGS乃至整个测序市场中的霸主地位已毋庸置疑。引用illumina官方说法：“世界上90%以上的测序数据都由Illumina仪器产生”，不较真的话，这句话确实在某种程度上反应了illumina雄踞NGS市场的现状。尤其是HiSeq系列测序仪的问世，以通量高，产量大，生产规模著称，能够快速、经济的进行大规模平行测序，在大型全基因组测序，全转录组，全外显子组测序，靶向基因测序方面优势明显。

下面是illumina测序仪产品发布的时间线：

发布日期

测序仪型号

2010.01

HiSeq 2000

2011.02

MiSeq

2012.01

HiSeq 2500

2013.11

MiSeq Dx

2014.01

HiSeq X Ten，NextSeq 500

2015.01

HiSeq X Five，HiSeq 3000，HiSeq 4000，NextSeq 550，MiSeq FGx

2016.01

MiniSeq

2017.01

NovaSeqTM系列

HiSeq 3000/4000系统则基于成熟的HiSeq 2500系统，采用创新的有序流动槽技术最大限度提高效率，3.5天内可完成12个基因组、100个转录组或180个外显子组测序。HiSeq 3000/HiSeq 4000测序系统为生产级测序能力设立了一个全新的标准。

HiSeq X Ten系统的问世完成了人类历史上一大里程碑事件——千元基因组时代的到来。HiSeq X Ten系统是由一套共10台超高通量的HiSeq X仪器组成，每年能带来超过18,000个人类基因组，而每个基因组的价格约为1000美元，让癌症和复杂疾病的研究达到新的水平。虽然目前GEO里面的数据HiSeq X Ten测序仪产出的数据并不是独占鳌头，但也只是时间问题。

NovaSeq系列测序仪问世，毫无疑问标志着测序新纪元的到来，旨在将基因组测序的价格进一步降至100美元。全新的NovaSeq系列测序系统，突破技术革新，具有可扩展的通量、灵活简便的配置和简化的操作流程，允许以更大的深度来发现罕见的遗传变异，为大规模发现复杂疾病变异打开了全新的市场。NovaSeq 测序平台单次运行最多可检测48个人类基因组，产出 6Tb 的数据量，运行时间缩短至40个小时。

illumina技术核心在于桥式PCR和边合成边测序（SBS）。illumina测序系统的碱基读取也是基于化学发光法来的，给每一个碱基加入荧光基团，通过拍照捕捉发光的碱基，如此就得到了DNA的原始序列信息。

也就是说，illumina原始读取的是图像数据文件，解析后才形成碱基序列文件。对应到序列文件，其测序源文件为BCL格式文件（per-cycle BCL basecall file），BCL是一种包含碱基信号和图块质量信息的二进制文件，在进入下游分析前，BCL文件会经由Casava碱基识别(Base Calling)转化为原始测序序列（Sequenced Reads），转化得到的序列我们称之为Raw Data或Raw Reads，格式为Fastq。

Fastq是一种文件文件，如果Fastq文件大小在M级，一般可以直接用文本编辑器（如Notepad++）打开。打开之后，就可以看到类似下面表格中第二列的内容，每四行记录一段序列，这个序列也是有名字的，叫reads。如果采用的是illumina MiSeq PE250，则第二行碱基和第四行碱基质量值均为250个，即reads长度为250 bp。

Illumina Seqence identifier

@HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1

Read bases

GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAG…

Phred quality scores(ASCII)

!’’((((+))%%%++)(%%%%).1*-+。。。

首行*illumina sequence identifier**记录的信息比较复杂

illumina sequence identifier中包含了此次测序的信息，根据平台不同包含的信息有所区别，一般来说可能包含以下的部分元素：

@::::::: :::
我们再回头看上面的例子，就可以对应查看这条序列文件中的测序信息了：

标识符

解释

@

必须以@开头

HWUSI-EAS100R

the unique instrument name

6

flowcell lane

73

tile number within the flowcell lane

941

‘x’-coordinate of the cluster within the tile

1973

‘y’-coordinate of the cluster within the tile

#0

index number for a multiplexed sample (0 for no indexing)

/1

the member of a pair, /1 or /2 (paired-end or mate-pair reads only)

注：Run、Flowcell、Lane和tile的详细辨析，我们在第2章节还会更详细的讲解fastq格式的数据。

1.32.5代测序
Ion Torrent 测序仪是第一个不需要光学系统的商业测序仪，所采用的技术为半导体测序，通过半导体芯片直接将化学信号转换为数字信号。是非常适合扩增子测序的革命性技术。它是一种经济、快速、简单、规模可扩展的测序技术。因为测序时间短，仪器设备便宜等特点而被各种研究所采用。

一、前世今生

Ion Torrent平台最初由Jonathan Rothberg于2007年开发，几经转手，2013年后归属Thermo Fisher，是他们家的掌中宝。目前有2010年发布的PGM，2012年发布Proton，2015年发布了Ion S5/XL。主要利用半导体芯片（无需荧光标记）技术，具有经济、快速、简单、规模可扩展的特点，适用于临床诊断和医学等使用场景，目前国内已有达安OEM版本DA8600。值得一提的是部分ion torrent测序仪受到了CFDA的认证。

二、半导体测序原理

Ion Torrent的核心是半导体芯片测序技术，该技术采集的信号为pH值的变化，其他第二代测序技术主要是通过拍照采集荧光信号。该技术的主要优点是快速，主要缺点与Roche公司的454技术相同，在判读单碱基重复序列时存在困难。

自然情况下，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个H+，导致局部可检验的PH值发生变化。如果发生结合，就会释放H+,相应的溶液PH值会发生改变，被离子传感器检测到，从而转换为数字信号。

如果检测DNA链上有两个相同的碱基，检测到的电压双倍，芯片则记录两个相同的碱基。

如果模板到的下个核苷酸与微芯片流的核苷酸不匹配，则检测不到电压，也不会记录碱基。

三、优缺点

torrent测序仪拥有图形化的用户界面，便捷的操作方式，商业化的试剂盒，这肯定是专门为医院的朋友们准备的，他们不需要具体的代码与分析原理，只需要按照protocol一步步照着做，点点按钮就能生成可用的临床报告了，应该说想法是好的，客户定位是准确的。但是我觉得NGS从实验到分析那么多步骤，如果不懂NGS分析原理与流程，对图形化的参数与文件不了解，很可能得不到理想的分析结果从而对torrent丧失信心。而torrent软件相对比较封闭，专业的数据分析人员不太好下手，所以普遍对torrent数据敬而远之。

1.4三代测序
层出不穷的三代小鲜肉中，表现最为亮眼的莫过于2010年推出的PacBio RS系列和2012年推出的Nanopore MinION。2015年PacBio又推出了万众瞩目的Sequel。 能进入三代测序仪队列的还有Nanopore公司，也在2017年推出了GridION，为更方便、快捷、准确、经济的测序提供了无限可能。

1.4.1异军突起的pacbio
PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。测序时，不需要对目标DNA进行PCR扩增，而是直接在目标片段两端加上两个发卡结构的接头，形成一个连续的环状结构。也因此，PacBio系统在读长上显示了极大的优势。目前比较受市场热捧的三代测序是PacBio的RSⅡ和2015年推出的Sequel。

PacBio下机产生的序列文件以HDF5格式存储。可以采用h5dump命令来查看H5文件内容。

1. 查看碱基序列：

用代码h5dump –d
/PulseData/BaseCalls/Basecall raw.h5 > Basecall.info ,文件内容如下：

DATA {(0): 67, 71,67, 67, 65, 71, 67, 71, 65, 65, 84, 71, 71, 67, 84, 71, 67, (17): 71, 71, 71,71, 65, 65, 71, 67, 65, 71, 65, 65, 65, 84, 84, 65, 84, (34): 67, 67, 71, 84,65, 65, 65, 67, 84, 71, 84, 84, 71, 67, 84, 71, 67,
该文件采用的ASCII码的编码方式存储的碱基序列：A=> 65, C=>67, G=>71, T=>84。

2. 查看碱基质量值：

用代码h5dump -d
/PulseData/BaseCalls/QualityValue raw.h5 > Basecall.quality,文件内容如下,其碱基质量值采用与illumina技术一致：

DATA {(0): 51, 44,42, 44, 24, 24, 51, 51, 51, 51, 50, 20, 20, 20, 50, 51, 51, (17): 48, 48, 48,47, 9, 9, 9, 51, 51, 46, 31, 31, 31, 31, 44, 51, 51, 30, (35): 30, 51, 51, 7,7, 7, 7, 51, 51, 44, 44, 44, 51, 51, 50, 27, 27, 26,
1.4.2长到天际的Nanopore
Oxford Nanopore 公司2005年在英国牛津成立，其运用的纳米孔测序技术使得DNA链在一个单通道中就能够被解码和识别，而不需要将长链打断成小短链。由于实现了DNA聚合酶内在自身的延续性和反应速度，Nanopore读长更长速度更快；同时由于能直接检测每个碱基的特征性电流，因而能对修饰碱基进行测序，对于表观遗传学研究具有极高的价值；因此，这款长到天际的测序仪，非常有潜力横扫当前测序格局。

2014年春天推出U盘大小的便携式MinION测序仪，仪器售价仅需$1000，据官网报道最长Reads可长达960 Kb，2014年10月推出平板大小的台式测序仪PromethION，有48个flow cell，可以单独运行也可以并行，2017年推出桌面式GridION X5测序仪。

Nanopore目前还主要在测试和生产阶段，尚未大规模应用，其应用主要体现在微生物等小基因组生物上。推出至今，其最亮眼的表现莫过于2014年西非埃博拉病毒爆发，MinION以最快的速度破译病毒序列，名噪一时。随着独特的纳米孔技术的成熟和完善，未来在即时检测、太空应用、大众检测等方面会有很大的想象空间。

Nanopore测序得到的序列文件的格式基础也是HDF5，下机产生后缀为Fast5的序列文档。Fast5文件可经由Poretools软件转换为Fastq文件或Fasta，然后进行后续数据分析。

① 应用Poretools将fast5转换为fastq，示例见： http://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fastq
② 应用Poretools将fast5转换为fasta，示例见： http://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fasta
在测序市场中，一代测序因其准确度高，仍作为突变检测、单菌鉴定等的金标准而存在。 以illumina HiSeq和MiSeq为代表的二代测序势头强劲，主打低成本和高通量，2017新机型NovaSeq更宣称已将测序成本降至百美金。 科研市场上三代测序最常见的莫过于PacBio，辅以冉冉上升的新星Nanopore等，主打长读长策略，直击二代测序碎片化序列的软肋，在基因组de novo上表现不俗，错误率较高，但可被矫正。