多位点序列分型_多位点序列分型(MLST)在艾伯特埃希菌鉴定中的应用

3 讨论

艾伯特埃希菌是一种新发现的肠道致病菌。起初通过常规检测方法被鉴定为致病性大肠杆菌(EPEC)或者出血性大肠杆菌(EHEC), 对该菌的误诊漏诊容易造成公众健康潜在的危险, 也会影响临床治疗效果。由于目前对其研究较少, 仍没有标准化检测方法和商品化鉴定系统, 利用分子生物学技术在基因水平上研究遗传进化关系, 则成为菌种鉴定的关键。

利用MLST对30株疑似艾伯特埃希菌分型过程中, 存在个别菌株的管家基因序列在大肠杆菌MLST数据库中未找到完全匹配的等位基因型, 可能属于新型别。采用双向测序, 将其完好的序列和峰图文件上传至MLST数据库以待确认, 上传前需核查PCR产物序列和峰图文件, 避免误判等位基因型及新型别; 此外, 在本实验样品7个管家基因PCR扩增时, 除purA外的其余6个管家基因产物测序峰图基本为单峰, 个别出现重峰、杂峰的通过多次扩增和降低模板浓度得到改善; 而全部样品purA基因测序产物重峰、杂峰情况严重, 存在非特异产物干扰, 结果无法用于比对分析。利用提高退火温度, 降低模板浓度, 多次扩增后测序效果并不理想, 最终改用数据库中purA其它引物进行扩增后, 产物特异性明显提高, 正反向测序峰图完好。这也提示我们发现测序峰图不完好时, 可通过多次PCR扩增测序、优化扩增条件和选取不同引物进行解决。

传统检测方法在新病原菌鉴定中存在局限, 而MLST可通过研究管家基因图谱与参考菌株相应序列构建系统进化树, 根据聚类分析结果判断菌种归属, 在新病原菌的鉴定和常见细菌新的变异方面发挥积极的作用。本研究MLST聚类分析结果显示30株菌为艾伯特埃希菌, 属国内首次发现并证实艾伯特埃希菌的存在。然后MLST针对的7个管家基因是大肠埃希菌的保守基因, 如若标本中混有大肠杆菌, PCR扩增为混合产物无法区分, 故不能直接作为该细菌PCR快速诊断。目前拟针对艾伯特埃希菌的特异基因建立PCR快速诊断方法。

综上所述, MLST为最终确认艾伯特埃希菌提供依据。同时也适用于其他新病原菌的诊断以及后续的分子流行病学研究、菌群遗传多态性、溯源等, 为制定有效的监测体系和预防疾病的流行与暴发提供有力的技术支持。