16、肿瘤精准医疗：生物标志物与液体活检的前沿进展

肿瘤精准医疗：生物标志物与液体活检的前沿进展

1. 靶向治疗时代的预测性生物标志物

在靶向治疗时代，预测性生物标志物和相关的靶向药物通常会并行进行验证和审批。常见的“预测性生物标志物/靶向药物”组合包括乳腺癌中的HER2扩增/曲妥珠单抗、慢性髓性白血病中的BCR - ABL易位/伊马替尼、非小细胞肺癌（NSCLC）中的EGFR突变/EGFR TKI以及黑色素瘤中的BRAF突变等，这些组合常指导治疗选择。

除了这些广为人知的癌症治疗反应预测生物标志物外，一些相对较新且更复杂的模型正在涌现。微卫星不稳定性（MSI）、同源重组缺陷（HRD）和肿瘤突变负荷（TMB）目前拥有最可靠的数据，可能很快会在临床实践中作为对DNA破坏剂、DNA修复靶向化合物和免疫治疗反应的预测指标。

1.1 同源重组缺陷（HRD）

同源重组（HR）是修复DNA双链断裂（DSBs）的重要遗传重组机制。BRCA1和BRCA2基因是HR介导的DNA修复的关键组成部分，这些基因的突变会导致HR途径失效。在HR缺陷的细胞中，其他DNA修复机制（如非同源末端连接（NHEJ）或碱基切除修复（BER））必须发挥作用。像聚（ADP核糖）聚合酶（PARP）抑制剂这类特定药物，就是针对这些替代途径设计的，这种治疗策略被称为“合成致死”，会使HR缺陷细胞凋亡。

HRD作为预测性生物标志物的独特之处在于其复杂性。BRCA1/2只是该途径中众多相关蛋白中的两个，为了使HRD成为可靠的生物标志物，需要同时对所有这些蛋白进行分析。目前有许多基于下一代测序（NGS）的检测面板可用于检测不同癌症中的HRD，能提供一个定量分数来显示HR模式是否受损。

1.2 微卫星不稳定性（MSI）

微卫星不稳定性指的是短核苷酸串联重复序列（微卫星）的高突变性，这主要是由于DNA错配修复（MMR）途径受损，通常是MMR基因（如MLH1、MSH2、MSH3、MSH6和PMS2）发生突变所致。

MSI在15%的散发性结直肠肿瘤中可见，也在子宫内膜、卵巢、尿道、胃、小肠、肝胆管、脑和皮肤等部位的肿瘤中被报道。如果发现是种系突变，MSI表型可确定一种名为“遗传性非息肉病性结直肠癌”（HNPCC）或林奇综合征的遗传疾病。

近期研究发现，高水平的MSI似乎能预测对免疫检查点抑制剂（ICPI）的良好反应，而MSI稳定的情况则往往相反。这一结果促使FDA在2017年5月批准帕博利珠单抗用于MSI - H癌症，这是历史上首个肿瘤无关药物的批准。

MSI通常通过PCR和免疫组织化学（IHC）检测进行分析，但最近专用的NGS面板已投入使用，与传统技术相比，显示出可行性和可靠性。与IHC和PCR相比，NGS方法的主要优势在于不需要正常组织（与PCR不同）、能提供定量结果（而IHC是定性检测），并且显然能提供更多信息以实现最佳的个性化治疗。

1.3 肿瘤突变负荷（TMB）

肿瘤突变负荷定义为肿瘤基因组编码区域内的体细胞突变数量。高突变负荷通常出现在与环境DNA损伤相关的肿瘤中，如肺癌（吸烟、环境污染）或黑色素瘤（日晒）。

TMB最近被确定为免疫治疗疗效的预测性生物标志物。其原理在于免疫治疗本身：TMB与癌细胞表达的多种新抗原相关，因此与ICPI激活针对癌细胞的免疫反应的潜在疗效相关。

关于TMB作为对ICPI反应的预测性生物标志物的主要证据来自对不同研究的回顾性分析，包括黑色素瘤、NSCLC和尿路上皮癌。尽管期待在III期试验中进行前瞻性验证，但早期试验表明TMB具有预测作用。在NSCLC和小细胞肺癌（SCLC）中，一线联合治疗纳武单抗 + 伊匹木单抗在TMB高的患者中显示出更有效。

传统上，TMB的定量通过全外显子测序进行，但这种方法准确但昂贵，不适合临床常规使用。因此，主要生物技术公司设计了特定的靶向面板，以简单且经济有效的方式定量TMB。许多独立试验已证明这些面板与全外显子测序相比具有可靠性，目前需要前瞻性试验来验证其在临床实践中的应用，以确定哪些患者更可能对免疫治疗有反应。

2. 液体活检

液体活检是一种非侵入性的血液检测方法，可检测从原发肿瘤和转移部位释放到血液中的循环肿瘤细胞（CTCs）和肿瘤DNA片段（无细胞肿瘤DNA - ctDNA）。

从研究实验室到临床实践，采集液体样本而非传统组织样本的方法正逐渐普及。液体活检只需简单的采血，克服了侵入性活检操作的可行性问题。由于同样的原因，它可以多次重复进行，没有风险或副作用，能提供肿瘤随时间演变的情况。此外，对ctDNA的分析可能更好地反映肿瘤异质性，有可能同时检测到不同的克隆。以下是液体活检一些有前景的潜在应用：

2.1 原发性疾病的早期诊断

通过经过验证的筛查检测早期发现癌症可能是液体活检最具雄心的目标。与所有筛查测试一样，高灵敏度、特异性和成本效益是基本要求。尽管最近开发了非常灵敏的技术，但可靠的早期癌症检测测试仍然是一个挑战。

Cohen等人最近推出了CancerSEEK面板，用于检测八种最常见的癌症（卵巢、肝脏、胃、胰腺、食管、结直肠、肺和乳腺）。该方法结合了对八种血液生物标志物的评估和对ctDNA中16个癌症相关基因的测序。在1005名临床检测为非转移性癌症的个体样本中，作者报告的中位灵敏度为70%（卵巢癌为98%，乳腺癌为33%），特异性≥99%。然而，这项研究存在一些局限性。首先，实验队列由临床检测出癌症的患者组成。在现实世界的筛查人群中，大多数个体的疾病可能不太严重，这可能会降低测试的灵敏度。其次，对照队列仅包括健康个体，没有考虑可能增加假阳性结果数量的所有合并症。

2.2 复发的早期检测

多项研究表明，CTCs的检测与各种实体肿瘤（尤其是早期疾病）的不良预后相关。

早期乳腺癌（EBC）的相关证据最多。Rack及其同事在2014年发表的最大规模试验中，使用CellSearch系统分析EBC患者的CTCs。2026名女性在辅助化疗前接受测试，1492名在治疗后接受测试。化疗前检测到CTCs与无病生存期和总生存期较差相关，辅助化疗后CTCs持续存在同样与不良预后相关。

除了乳腺癌，CTCs计数也被评估为许多其他肿瘤类型（如结直肠癌、膀胱癌、肝癌、头颈部癌和睾丸生殖细胞肿瘤）转移复发的预后标志物。

对无细胞肿瘤DNA进行分析也可用于预测转移复发。在2015年发表的两项不同研究中，对EBC患者的ctDNA进行了连续评估，以早期检测转移。在这两个案例中，对连续样本中的突变追踪都能准确预测转移复发，在某些情况下，比临床复发提前数月（平均8 - 11个月）。Reinert等人在早期结直肠癌患者中进行了类似试验，结果表明使用NGS方法分析ctDNA与传统随访相比，能提前10个月检测到转移复发。

综合这些证据表明，对高风险、早期癌症患者进行液体活检筛查，可能为在临床转移发生前进行干预创造治疗窗口。

2.3 驱动/耐药突变的检测和治疗的实时监测

如前所述，检测驱动和耐药突变是NGS的关键应用。通常对活检或手术标本（通常来自原发肿瘤，有时来自转移部位）的组织样本进行DNA分析，这些样本会存档在病理实验室，随时可用于进一步分析。然而，这些样本可能只是“静态”图像，无法反映药物压力下的时间演变。此外，转移复发通常在原发肿瘤切除数年后发生，从该标本获得的信息可能过时。在临床实践中，对原发肿瘤和转移部位进行连续组织活检是不可行的。相反，液体活检允许在治疗过程中进行重复分析，提供肿瘤基因组的动态可靠图像，可用于实时监测治疗。

在转移性乳腺癌中，治疗选择取决于雌激素受体（ER）表达和HER2扩增。ER阳性的转移性乳腺癌（MBC）患者适合激素治疗，通常持续到出现耐药和疾病进展。内分泌治疗获得性耐药的常见原因是肿瘤异质性，ER阳性乳腺癌患者可能存在ER阴性的CTCs。

ER基因本身的突变也是耐药的常见原因。Chu等人证明，在ctDNA中可以很容易地识别ER基因（ESR1）的体细胞突变，并且这些突变与内分泌治疗失败相关。液体活检也成功应用于ESR1甲基化分析，已知ESR1甲基化导致ESR1表观遗传沉默（ER下调）和继发性内分泌耐药的发展。

HER2癌基因是MBC治疗中的另一个关键靶点。在高达30%的病例中，CTCs和原发肿瘤的HER2状态存在差异。这一发现促使开展了专门的干预性试验，使在初次评估中HER2阴性的患者可以根据CTCs的HER2状态接受抗HER2药物治疗。

在结直肠癌中，NRAS、KRAS和BRAF状态是优化治疗的必要条件。许多研究报告了组织样本和ctDNA的突变分析之间的高度一致性。此外，液体活检能更好地反映肿瘤异质性，检测到组织样本中未发现的RAS突变。在使用抗EGFR治疗期间对KRAS状态进行突变分析，还可以在影像学评估前数月预测疾病进展。

肺癌是基于突变状态进行个性化治疗的典型例子。液体测序已被证明是组织活检的可靠替代方法。2016年6月1日，FDA批准了“Cobas EGFR Mutation Test v2”作为临床实践中首个可用的液体活检测试，用于检测EGFR基因的外显子19缺失或外显子21替换。如果检测结果为阴性，指南建议使用组织样本进行常规测试。

在使用酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗期间，通过液体活检进行EGFR分析也是一种有用的工具，可检测导致治疗耐药的EGFR突变。Oxnard等人分析了9名接受厄洛替尼治疗的EGFR突变NSCLC患者的血浆ctDNA，所有患者在治疗开始前T790M突变均为阴性，但在三分之二的患者中，连续ctDNA分析显示在影像学进展前长达16周T790M EGFR突变水平升高，提前预示了临床 - 影像学进展。

雄激素阻断是前列腺癌治疗的基石，但几乎所有患者都会进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。雄激素受体的基因组和转录组改变（主要是AR扩增和AR剪接变体）是进展为去势抵抗的主要原因。

AR - v7是AR的一种剪接变体，由于缺乏配体结合域而持续激活。检测到AR - v7时，它不仅导致对经典一线雄激素剥夺治疗耐药，还导致对常用于CRPC的第二代抗雄激素药物（如恩杂鲁胺和阿比特龙）耐药。AR - v7通常通过分析CTCs中的mRNA进行检测。

约翰霍普金斯大学最近发表的一项临床审计证实了AR - v7作为预测性生物标志物的潜力，表明了解其情况可影响53%患者的临床决策。然而，圣加仑前列腺癌会议不鼓励在临床实践中常规使用AR - v7检测，主要原因是只有单中心经验，且仍缺乏前瞻性的外部验证。此外，在未接触阿比特龙、恩杂鲁胺或紫杉烷的患者中，AR - V7阳性率为3%，仅在使用第二代抗雄激素药物进展后才增加（19 - 39%）。因此，该小组认为它在一线治疗中的价值有限，因为检测率低；在二线治疗中，化疗已成为首选治疗方法。

2.4 肿瘤异质性的表征

同一肿瘤类型的个体之间存在遗传多样性（肿瘤间异质性），单个肿瘤内部也存在异质性（肿瘤内异质性，ITH）。ITH包括空间异质性（同一病变内和不同部位的不同亚克隆）和时间异质性（在肿瘤演变过程中出现）。

“主干和分支”模型常用于表示ITH。在主干中发现的驱动体细胞改变在肿瘤自然史的早期出现，对肿瘤生长至关重要，因此在每个亚克隆和肿瘤区域都可检测到。相反，在癌症演变后期发生的亚克隆突变并非均匀分布，仅存在于一部分癌细胞中，构成了树的分支。

大约40年前，Peter Nowell首次提出癌症是一个克隆进化过程的理论，即连续的克隆选择导致肿瘤异质性。然而，直到多年后下一代测序技术出现，该理论才在临床实践中得到应用。在临床实践中，对原发和转移病变进行连续广泛的组织采样是不可行的，并且由于只分析有限的地理区域，可能会出现采样偏差。

下一代测序的出现极大地提高了我们对肿瘤演变的理解，开始在单核苷酸水平上解决ITH的复杂性。由于ctDNA是组织活检的可靠非侵入性替代物，对ctDNA进行大规模平行测序可能是研究ITH最强大的工具。

在一项概念验证研究中，De Mattos - Arruda等人对一名同步ER + / HER2 - 转移性乳腺癌患者的原发癌、肝转移灶和血浆ctDNA进行了基因组测序。使用包含300个癌症相关基因的靶向面板，他们在ctDNA中发现了原发肿瘤和/或肝转移灶中存在的所有突变，而并非所有在转移灶中检测到的突变都能在原发肿瘤中可靠识别。作者成功证明ctDNA测序显然是研究异质性的强大工具，能准确反映在所有肿瘤部位检测到的完整突变谱。

许多针对不同癌症类型的研究也得出了类似结果。基于这一假设，正在进行的试验旨在从早期诊断到肿瘤进展和转移扩散的不同阶段，前瞻性地监测疾病演变。

TRACERx是该研究领域的一个开创性项目。它由四项平行观察性研究（肺癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌）组成，其宏伟目标是了解转移中的癌症基因组演变、免疫逃逸、适应和临床结果之间的关系。

2.5 CTCs和ctDNA分析

CTCs和ctDNA是具有互补作用的癌症生物标志物。它们提供不同的信息，根据具体研究需求和临床背景，其有用性有所不同。

CTCs可以通过多种方法分离，包括物理、免疫、分子或功能检测。市场上有几种用于检测CTCs的平台，但CellSearch®系统是唯一获得FDA批准用于临床的系统。它是一种基于抗体的检测方法，通过正负选择的双重检查来分离CTCs。CellSearch将EpCAM（上皮细胞粘附分子）阳性、细胞角蛋白阳性且CD45阴性的细胞识别为CTCs。

多年来，CTCs计数一直单独用作肿瘤预后生物标志物。最近，分离和测序技术的进步改变了这一观点，为单细胞水平的DNA、RNA和蛋白质分析铺平了道路。然而，CTCs的检测仍然具有挑战性，特别是因为它们在血液中的浓度非常低。检测和富集步骤都需要灵敏且特异的分析方法，这只有通过昂贵的技术才能实现。

用于ctDNA分析的主要技术是微滴数字PCR（ddPCR）和下一代测序。ddPCR是一种靶向方法，主要用于检测选定的突变，灵敏度高且成本效益好，能绝对定量突变和野生型拷贝。相反，NGS可以是靶向的（基因面板）或非靶向的（全外显子测序、全基因组测序），虽然复杂且昂贵，但通量更高，能更全面地检测所有已知和未知的基因组改变（单核苷酸变异、插入缺失、拷贝数变异、结构变异），无需预先选择任何基因。

综上所述，预测性生物标志物和液体活检在肿瘤精准医疗中展现出巨大的潜力。HRD、MSI和TMB等生物标志物为治疗选择提供了新的依据，而液体活检则以其非侵入性、可重复性和能反映肿瘤异质性等优势，在早期诊断、复发监测、突变检测和肿瘤异质性研究等方面具有广阔的应用前景。随着技术的不断发展和研究的深入，相信它们将在未来的肿瘤治疗中发挥更加重要的作用。

以下是几种生物标志物和检测技术的对比表格：
| 生物标志物/技术 | 定义 | 检测方法 | 临床应用 | 优势 | 局限性 |
| — | — | — | — | — | — |
| HRD | 同源重组缺陷，BRCA1/2等基因突变导致HR途径失效 | NGS测序面板 | 指导PARP抑制剂治疗 | 可定量评估HR模式 | 分析复杂，需同时分析多种蛋白 |
| MSI | 微卫星不稳定性，由MMR基因突变导致 | PCR、IHC、NGS面板 | 预测ICPI疗效，指导帕博利珠单抗治疗 | 无需正常组织，可定量，信息丰富 | |
| TMB | 肿瘤基因组编码区域内的体细胞突变数量 | 全外显子测序、靶向面板 | 预测免疫治疗疗效 | 与免疫治疗疗效相关 | 传统方法昂贵，新面板需前瞻性验证 |
| 液体活检（CTCs） | 检测血液中的循环肿瘤细胞 | CellSearch系统等 | 预后评估，指导治疗 | 可实时监测肿瘤状态 | 检测难度大，成本高 |
| 液体活检（ctDNA） | 检测血液中的无细胞肿瘤DNA | ddPCR、NGS | 早期诊断、复发监测、突变检测 | 反映肿瘤异质性，可重复检测 | |

下面是液体活检应用的mermaid流程图：

graph LR
    classDef startend fill:#F5EBFF,stroke:#BE8FED,stroke-width:2px;
    classDef process fill:#E5F6FF,stroke:#73A6FF,stroke-width:2px;
    classDef decision fill:#FFF6CC,stroke:#FFBC52,stroke-width:2px;

    A([开始液体活检]):::startend --> B(采集血液样本):::process
    B --> C{检测目的}:::decision
    C -->|早期诊断| D(分析ctDNA和血液生物标志物):::process
    C -->|复发检测| E(检测CTCs和ctDNA突变):::process
    C -->|突变检测和治疗监测| F(分析ctDNA中的驱动和耐药突变):::process
    C -->|肿瘤异质性分析| G(对ctDNA进行大规模平行测序):::process
    D --> H(评估结果，判断是否有癌症迹象):::process
    E --> I(判断复发风险):::process
    F --> J(调整治疗方案):::process
    G --> K(了解肿瘤异质性情况):::process
    H --> L([结束，采取相应措施]):::startend
    I --> L
    J --> L
    K --> L

3. 技术对比与展望

3.1 生物标志物与检测技术对比

为了更清晰地了解各种生物标志物和检测技术的特点，我们对前面提到的内容进行了总结，以下是详细的对比表格：
| 生物标志物/技术 | 定义 | 检测方法 | 临床应用 | 优势 | 局限性 |
| — | — | — | — | — | — |
| HRD | 同源重组缺陷，BRCA1/2等基因突变导致HR途径失效 | NGS测序面板 | 指导PARP抑制剂治疗 | 可定量评估HR模式 | 分析复杂，需同时分析多种蛋白 |
| MSI | 微卫星不稳定性，由MMR基因突变导致 | PCR、IHC、NGS面板 | 预测ICPI疗效，指导帕博利珠单抗治疗 | 无需正常组织，可定量，信息丰富 | |
| TMB | 肿瘤基因组编码区域内的体细胞突变数量 | 全外显子测序、靶向面板 | 预测免疫治疗疗效 | 与免疫治疗疗效相关 | 传统方法昂贵，新面板需前瞻性验证 |
| 液体活检（CTCs） | 检测血液中的循环肿瘤细胞 | CellSearch系统等 | 预后评估，指导治疗 | 可实时监测肿瘤状态 | 检测难度大，成本高 |
| 液体活检（ctDNA） | 检测血液中的无细胞肿瘤DNA | ddPCR、NGS | 早期诊断、复发监测、突变检测 | 反映肿瘤异质性，可重复检测 | |

从这个表格中我们可以看出，不同的生物标志物和检测技术各有优劣。在实际临床应用中，需要根据具体的情况选择合适的方法。例如，对于想要快速检测特定突变的情况，ddPCR可能是一个不错的选择；而对于全面了解肿瘤基因组信息，NGS则更为合适。

3.2 未来发展方向

随着科技的不断进步，肿瘤精准医疗领域也将迎来更多的发展机遇。以下是一些可能的未来发展方向：
1. 技术优化 ：现有的检测技术如NGS、ddPCR等可能会不断优化，变得更加准确、快速和经济。例如，降低检测成本可以使更多的患者受益于这些先进的检测技术。
2. 多组学整合 ：将基因组学、转录组学、蛋白质组学等多组学数据进行整合分析，能够更全面地了解肿瘤的生物学特性，为个性化治疗提供更精准的依据。
3. 新型生物标志物的发现 ：除了现有的HRD、MSI、TMB等生物标志物，未来可能会发现更多新的生物标志物，进一步提高治疗的针对性和有效性。
4. 液体活检的广泛应用 ：液体活检作为一种非侵入性的检测方法，具有很大的发展潜力。未来可能会在更多的癌症类型中得到应用，并且在早期诊断、复发监测等方面发挥更大的作用。

3.3 面临的挑战

尽管肿瘤精准医疗取得了很大的进展，但仍然面临一些挑战：
1. 数据解读 ：随着检测技术的发展，产生的数据量越来越大，如何准确解读这些数据并将其应用于临床决策是一个挑战。
2. 标准化问题 ：不同的检测方法和实验室之间可能存在差异，需要建立统一的标准和规范，以确保检测结果的准确性和可比性。
3. 伦理和法律问题 ：精准医疗涉及到患者的基因信息等敏感数据，如何保护患者的隐私和权益，以及如何解决可能出现的伦理和法律问题，是需要关注的方面。

4. 总结

肿瘤精准医疗是当前癌症治疗领域的重要发展方向，预测性生物标志物和液体活检技术在其中发挥着关键作用。HRD、MSI和TMB等生物标志物为治疗选择提供了新的视角，帮助医生更精准地选择合适的治疗方案。液体活检以其非侵入性、可重复性和能反映肿瘤异质性等优势，在早期诊断、复发监测、突变检测和肿瘤异质性研究等方面具有广阔的应用前景。

然而，我们也应该认识到，肿瘤精准医疗仍然面临一些挑战，需要不断地进行技术创新和研究探索。未来，随着技术的不断进步和多学科的交叉融合，相信肿瘤精准医疗将为癌症患者带来更好的治疗效果和生存质量。

为了更直观地展示肿瘤精准医疗的整体流程，以下是一个mermaid流程图：

graph LR
    classDef startend fill:#F5EBFF,stroke:#BE8FED,stroke-width:2px;
    classDef process fill:#E5F6FF,stroke:#73A6FF,stroke-width:2px;
    classDef decision fill:#FFF6CC,stroke:#FFBC52,stroke-width:2px;

    A([患者就诊]):::startend --> B(进行液体活检或组织活检):::process
    B --> C(检测生物标志物，如HRD、MSI、TMB等):::process
    C --> D{根据生物标志物结果选择治疗方案}:::decision
    D -->|特定靶向治疗| E(使用相应靶向药物):::process
    D -->|免疫治疗| F(使用免疫治疗药物):::process
    D -->|其他治疗| G(选择合适的传统治疗方法):::process
    E --> H(治疗过程中进行液体活检监测):::process
    F --> H
    G --> H
    H --> I{判断治疗效果}:::decision
    I -->|有效| J(继续当前治疗):::process
    I -->|无效| K(调整治疗方案):::process
    J --> L(定期复查):::process
    K --> C
    L --> M([治疗结束，随访观察]):::startend

这个流程图展示了从患者就诊到治疗结束的整个过程，体现了生物标志物检测和液体活检在其中的重要作用。通过不断地监测和调整治疗方案，有望提高癌症患者的治疗效果。